单细胞免疫组库TCR/BCR测序

免疫组库（Immune Repertoire，IR）是指机体内 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞多样性的总和，反映机体免疫系统在特定时间段内应对外界刺激应答的能力。基于 10x Genomics 的单细胞系统，可实现高通量的单细胞转录组和 V(D)J 测序。不但可以将 TCR/BCR 双链匹配，而且能够同时获得基因表达信息。

10x Genomic 单细胞免疫组库测序与单细胞 RNA 测序一样，通过微流控系统将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中；接下来在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放 mRNA，通过逆转录产生带有 10x barcode 和 UMI 信息的 cDNA。破油（Breaking Emulsions）之后，cDNA 一分为二，后续同时进行基因表达和免疫组库的文库构建。其中 TCR 或者 BCR 的 V(D)J 序列通过设计在 C 区的巢式引物进行 PCR 富集；而 mRNA 的信息，与 10x Genomics 3’mRNA 文库不同，保留的是 5’端的信息。测序后即可一次性获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据。

技术应用

1.肿瘤治疗

研究多种肿瘤类型(结直肠癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤等) 的浸润淋巴细胞，捕捉肿瘤发生时免疫微环境的变化，寻找免症治疗的靶点，从而辅助免疫治疗更好的抗击肿瘤。

2.移植和免疫重建

器官或者骨髓移植时，经常会诱发宿主排斥反应的发生，从而发生慢性移植抗宿主病。免疫组库测序技术可以检测移植后T细胞库，进行从而识别移植后感染或者复发的高危人群。

3.自身免疫疾病

分析异常表达的免疫细胞(T细胞或抗体) ，发现临床诊断的标志物。寻找优于现有标准的生物标记物、研究免疫系统在自身免疫中的机制，从而为疾病的诊疗提供依据。

4.用药及疫苗评估

对疾病用药后的外周血样本进行评估，确认药物是否激发免疫反应及其功效；获得特征性的BCR (IG) 序列，缩短抗体开发的流程。

5.其他方面

免疫组库在感染性疾病、免疫谱的差异状态调查、免疫疗法研究等方面提供重要的依据。

技术原理

10x Genomic 单细胞免疫组库测序与单细胞 RNA 测序一样，通过微流控系统将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中；接下来在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放 mRNA，通过逆转录产生带有 10x barcode 和 UMI 信息的 cDNA。破油（Breaking Emulsions）之后，cDNA 一分为二，后续同时进行基因表达和免疫组库的文库构建。其中 TCR 或者 BCR 的 V(D)J 序列通过设计在 C 区的巢式引物进行 PCR 富集；而 mRNA 的信息，与 10x Genomics 3’mRNA 文库不同，保留的是 5’端的信息。测序后即可一次性获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据。

技术优势

1.高通量

基于10x Genomics单细胞捕获平台可实现上万个细胞的免疫组库多样性检测

2.高分辨率

可获得真正单细胞水平的的免疫组库信息

3.信息全面

扩增区域是V(D)J全长基因序列，获取免疫组库多样性更全面

4.双链精准匹配

单细胞水平可高效匹配BCR的重链和轻链以及TCR的α链和β链

5.单细胞表达

同时测定同一细胞匹配的免疫组库(TCR/BCR)信息和5’基因表达

6.强大生信分析

实现单细胞免疫组库和基因表达联合分析挖掘更多的细胞互作，提供个性化分析

建库流程

10x V(D)J测序与其转录组测序建库流程基本相同，都要经历微流控构建单细胞油包水反应体系，mRNA逆转录为cDNA并扩增的过程。与常规10x单细胞转录组测序把barcode和UMI序列放在3'端不同，V(D)J测序要把barcode和UMI序列放在5'端。样本逆转录的cDNA经过扩增后可以一分为二，一部分做5’端scRNA测序，另一部分用富集引物扩增V(D)J序列测序。

Step 1:GEM Generation & Barcoding

Step 2:Post GEM-RT Cleanup &cDNA Amplification

在GEM-RT反应之后，使用磁珠富集纯化带有10x barcode的第一链cDNA，然后PCR扩增cDNA。这一步扩增的产物可以同时用来构建T细胞、B细胞建库(Step3-4)和5’基因表达文库(Step5)

Step 3 & 4:V(D)J Amplification from cDNA and V(D)J Library Construction

扩增得到的全长V(D)J序列会被酶切为长短不一的片段。因为每条V(D)J序列都有很多个PCR扩增的拷贝，并且这些拷贝有相同的UMI标签，所以每条V(D)J序列都会得到一组测序reads(通过UMI确定同一来源)。

Step 5:5'Gene Expression(GEX) Library Construction

Step 6:Sequencing

分析内容

生物信息学分析流程

高级信息分析

1. 拟时序分析：

2.下游分析:

3.联合分析：

RACE mRNA-Seq文库信息分析内容(免疫组库分析)

送样要求

(1) 样品总量：制备成细胞悬浮液，一个样本的细胞起始量需大于1×10⁵个；

(2) 样品浓度：最终上样捕获前细胞浓度在700 - 1,200 cells/μL；

(3) 细胞活性：活细胞数目在85%以上，细胞间无黏连；

(4) 细胞大小：直径小于40μm；

(5) 细胞培养基及缓冲液不能含有Ca²⁺和Mg²⁺等影响酶活性的物质；

(6) 血液样本需要用EDTA抗凝管收集，不能采用含有肝素的抗凝管；

(7) 植物样本需制备成原生质体。