细胞划痕实验

细胞划痕实验

一、实验原理

细胞划痕实验（Cell scratch assay）是通过在细胞单层上划痕并通过延时显微镜定期捕获图像，从而研究细胞迁移运动、修复能力和细胞间相互作用的实验室技术，基本原理是：在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕/伤口”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕/伤口”愈合，于细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像，通过测量不同时间点的划痕间距并计算差值，可对细胞的迁移能力做出判断。因其类似体外伤口愈合过程，又名伤口愈合实验(Wound healing assay)。可用于可以观察药物、基因等外源因素对细胞迁移、修复和相互作用的影响。

二、实验步骤

1. 划线：先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过5条线；

2. 铺板：处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种于6孔培养板；细胞铺板6w/孔，接种原则为过夜后融合率达到100%，每孔最终的培养基总量2mL；

3. 细胞培养37℃、5％CO2培养箱中培养24h；

4. 划痕：第二天用200微升枪头比着6孔板盖子或直尺，平行或垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜；

划痕划线示意图（横线为马克笔划线，竖线为划痕）

5. 清洗：PBS冲洗细胞3次，除去划下的细胞，加入无血清培养基；

6. 拍照：擦去6孔板背后的marker横线划痕。4倍镜下进行拍照，保证划痕居中且垂直，注意背景一致，加入待测样本，设置浓度梯度，可按0，6，12，24h时间点取样，拍照。

7. 结果分析，使用Image J软件打开图片后，随机划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值或者划痕面积均值。

8. 数据处理：

细胞迁移率(伤口愈合率)=(初始划痕面积-t时刻划痕面积)/初始划痕面积

细胞迁移率(伤口愈合率)=(初始细胞间距离均值-t时刻细胞间距离均值)/初始细胞间距离均值。

三、注意事项

1. 划线的目的只是为了辅助划痕时划的更直，有利于后续拍照分析，划线会在拍照前擦去。

2. 细胞接种数量需根据细胞生长速度和状态而定，接种原则为过夜后融合率达到100%，即细胞间没有空隙，否则会影响后续拍照分析。

3. 同浓度不同孔之间划痕最好使用同一只枪头，减少划痕距离的误差。划痕时枪头垂直，不能倾斜，可比着直尺或孔板盖，保持力度一致，一次性划完。

4. 冲洗时要温柔，贴壁加入，避免冲掉单层细胞，反复多次冲洗，尽量洗掉所有的细胞碎片。

5. 降低细胞增殖对迁移造成的假阳性结果的方法：①使用无血清或低血清培养基(<2%)可降低细胞增殖对实验结果的影响；②一般认为24h为细胞的一个周期，在选取合适的时间点(6，12，24h)检测划痕宽度时，最好不要超过细胞一个周期的时间；③如果要单纯考虑细胞迁移，可以先用丝裂霉素(1µg/ml)处理1h，抑制细胞的分裂。

6. 尽量保证各个划痕宽度一致, 人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷。