周期检测 (PI)

细胞周期（PI）

细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，称为细胞周期，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。可用于细胞周期检测的荧光染料有碘化丙啶（Propidium，简称PI）、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，简称DAPI)、Hochest、7氨基放线菌素（7-Amino-ActinomycinD，简称7AAD）等。PI法是较常见的一种周期检测方法。

【应用简介】

细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，称为细胞周期，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。可用于细胞周期检测的荧光染料有碘化丙啶（Propidium，简称PI）、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，简称DAPI)、Hochest、7氨基放线菌素（7-Amino-ActinomycinD，简称7AAD）等。PI法是较常见的一种周期检测方法。

【实验原理】

PI是一种双链DNA的荧光染料，与双链DNA结合后可产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被PI染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可进行细胞周期分析。PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

【实验方法】

1. 细胞样品的准备：

    收集细胞，用1ml预冷PBS洗1遍，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

2. 细胞固定：

    加入1ml预冷的70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定2h或更长时间（固定12-24h可能效果更佳）。1000g离心3-5分钟，沉淀细胞（如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或加大离心力）。弃上清，用用1ml预冷PBS洗1遍。

3. PI染色：

    每个样品用0.5ml染色缓冲液（或PBS）重悬，加入25ul PI染色液（20×）、10ul RNase A（50×）。37℃避光温浴30分钟。

4. 流式检测：

    用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

【注意事项】

1. 细胞浓度一定要≧1×10⁶/ml，特别是阴性对照管细胞量要大一些，以便样品电压调节；

2. 必须保证被检测样品为单细胞悬液；

3. 如果样品细胞为培养的贴壁细胞，将上清转入离心管（其中含有脱落的凋亡细胞），与不含EDTA的胰酶消化的细胞合并后离心收集细胞；

4. 在细胞固定时一定要将细胞吹开，吹成单细胞悬液；

5. PI综合染液不能用蒸馏水配，否则细胞全部溶解，造成结果不可靠；

6. 4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料显示-20℃可以至少保存一个月。