质粒转染

质粒转染

质粒转染是指利用不同的载体物质携带质粒DNA通过直接穿膜或膜融合的方法将外源DNA分子导入真核细胞，使外源基因表达，从而针对某个基因和蛋白质的功能进行一系列生物学功能研究的方法。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断深入，DNA转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规实验工具。质粒转染在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生命科学前沿研究中，应用越来越广泛。

【应用简介】

质粒转染是指利用不同的载体物质携带质粒DNA通过直接穿膜或膜融合的方法将外源DNA分子导入真核细胞，使外源基因表达，从而针对某个基因和蛋白质的功能进行一系列生物学功能研究的方法。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断深入，DNA转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规实验工具。质粒转染在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生命科学前沿研究中，应用越来越广泛。

【实验原理】

质粒转染是指利用不同的载体物质携带质粒DNA通过直接穿膜或膜融合的方法将外源DNA分子导入真核细胞，使外源基因表达，从而针对某个基因和蛋白质的功能进行一系列生物学功能研究的方法。

【实验方法】

质粒DNA导入细胞有多种方法，包括物理介导（电穿孔法、显微注射和基因枪）、化学介导（磷酸钙共沉淀法、载体转染法等）和生物介导（原生质体转染、病毒介导的转染）三类途径。这三类技术中，又以载体转染法最为常用。国际上应用较早的转染载体多为脂质体类载体，但此类转染载体细胞毒性较大，转染效率往往也不够理想。近年类，纳米生物材料类载体的应用逐渐增多，此类载体最大的优点是细胞毒性较低，部分品牌载体的转染效率也显著优于脂质体类载体。

【注意事项】

1、细胞密度

细胞铺板与转染最好当天进行，一般来说，当细胞密度达到70%～90%时进行转染可以取得较高的转染效率，过低或过高都会影响转染效果。

2、细胞状态

这点是核心，很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。传代尽量保证细胞分布均匀、密度合适，如果有细胞分布不均导致聚集成团或传代密度太大细胞连成一片，则单个细胞与培养液的接触面积减少，脂质体进入细胞的几率下降，导致质粒转染效率低下。

其次，尽量选择无支原体污染的细胞，支原体污染是无法通过视觉检查发现的，严重影响着质粒转染效率，可以改可用支原体检测试剂盒进行检测，确保无支原体污染。

3、细胞种类

不同细胞种类的细胞在做转染时所需要的转染体系是不同的，不能一种体系用在所有类型细胞的转染实验。 如上所示，针对昆虫细胞转染、293细胞小试转染、ExpiCHO细胞转染我们分别使用了三种不同的转染体系。

4、DNA纯度

在制备高纯度DNA时，还需要对DNA进行内毒素的去除，内毒素的存在会造成细胞毒性，严重影响转染效率，因此我们在做质粒转染时，对交付的质粒有如下要求：

1. 交付的质粒使用TE溶解（10 mM Tris-HCl,1 mMEDTA）；

2. A260/A280比值在1.8-2.0之间，质粒浓度在1000 ng/ul左右；

3. 内毒素小于0.128 eu/ug；

4. 质粒大抽要求：无内毒素、无苯酚、无氯化钠；

5. 质粒需经过跑胶鉴定，超螺旋质粒含量大于50%，无明显蛋白污染。

5、转染试剂

转染试剂的原则是高效、低毒、方便、廉价，每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。

质粒转染

质粒转染是指利用不同的载体物质携带质粒DNA通过直接穿膜或膜融合的方法将外源DNA分子导入真核细胞，使外源基因表达，从而针对某个基因和蛋白质的功能进行一系列生物学功能研究的方法。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断深入，DNA转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规实验工具。质粒转染在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生命科学前沿研究中，应用越来越广泛。

【应用简介】

质粒转染是指利用不同的载体物质携带质粒DNA通过直接穿膜或膜融合的方法将外源DNA分子导入真核细胞，使外源基因表达，从而针对某个基因和蛋白质的功能进行一系列生物学功能研究的方法。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断深入，DNA转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规实验工具。质粒转染在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生命科学前沿研究中，应用越来越广泛。

【实验原理】

质粒转染是指利用不同的载体物质携带质粒DNA通过直接穿膜或膜融合的方法将外源DNA分子导入真核细胞，使外源基因表达，从而针对某个基因和蛋白质的功能进行一系列生物学功能研究的方法。

【实验方法】

质粒DNA导入细胞有多种方法，包括物理介导（电穿孔法、显微注射和基因枪）、化学介导（磷酸钙共沉淀法、载体转染法等）和生物介导（原生质体转染、病毒介导的转染）三类途径。这三类技术中，又以载体转染法最为常用。国际上应用较早的转染载体多为脂质体类载体，但此类转染载体细胞毒性较大，转染效率往往也不够理想。近年类，纳米生物材料类载体的应用逐渐增多，此类载体最大的优点是细胞毒性较低，部分品牌载体的转染效率也显著优于脂质体类载体。

【注意事项】

1、细胞密度

细胞铺板与转染最好当天进行，一般来说，当细胞密度达到70%～90%时进行转染可以取得较高的转染效率，过低或过高都会影响转染效果。

2、细胞状态

这点是核心，很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。传代尽量保证细胞分布均匀、密度合适，如果有细胞分布不均导致聚集成团或传代密度太大细胞连成一片，则单个细胞与培养液的接触面积减少，脂质体进入细胞的几率下降，导致质粒转染效率低下。

其次，尽量选择无支原体污染的细胞，支原体污染是无法通过视觉检查发现的，严重影响着质粒转染效率，可以改可用支原体检测试剂盒进行检测，确保无支原体污染。

3、细胞种类

不同细胞种类的细胞在做转染时所需要的转染体系是不同的，不能一种体系用在所有类型细胞的转染实验。 如上所示，针对昆虫细胞转染、293细胞小试转染、ExpiCHO细胞转染我们分别使用了三种不同的转染体系。

4、DNA纯度

在制备高纯度DNA时，还需要对DNA进行内毒素的去除，内毒素的存在会造成细胞毒性，严重影响转染效率，因此我们在做质粒转染时，对交付的质粒有如下要求：

1. 交付的质粒使用TE溶解（10 mM Tris-HCl,1 mMEDTA）；

2. A260/A280比值在1.8-2.0之间，质粒浓度在1000 ng/ul左右；

3. 内毒素小于0.128 eu/ug；

4. 质粒大抽要求：无内毒素、无苯酚、无氯化钠；

5. 质粒需经过跑胶鉴定，超螺旋质粒含量大于50%，无明显蛋白污染。

5、转染试剂

转染试剂的原则是高效、低毒、方便、廉价，每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。