细胞自噬细胞自噬检测服务 细胞自噬检测服务用于研究多种因素能够诱导细胞发生自噬如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等。但是关于自噬信号的传递，现有的研究只明确了几种信号通路，包括抑制类和激活类，但具体的机制尚在研究中。 【应用简介】 细胞自噬检测服务用于研究多种因素能够诱导细胞发生自噬如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等。但是关于自噬信号的传递，现有的研究只明确了几种信号通路，包括抑制类和激活类，但具体的机制尚在研究中。 自噬（Autophagy），或称自体吞噬，是一个涉及到细胞自身结构通过溶酶体机制而被分解的过程，该过程是一个受到紧密调控的步骤，帮助细胞产物在合成、降解以及接下来的循环中保持一个平衡状态。细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个扁平的类似“脂质体”样的膜结构，称为Phagophore。随着Phagophore不断延伸，将胞浆中的细胞器等成分，全部包裹住成为密闭的结构，称为“自噬体（autophagosome）”。 【实验原理】 自噬体形成后，可与溶酶体融合，自噬体中的内容物随即被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。自噬（Autophagy）是一类细胞内物质降解的代谢过程，待降解的胞内物质首先被自噬小泡包裹，随后被溶酶体中的水解酶降解。研究发现微管相关蛋白轻链3（MAP-LC3），简称LC3，参与了自噬的形成，并被证明了是哺乳动物细胞中常见的自噬小体标记蛋白之一。 Western blot可能会检测到LC3的两种形式，这是由于自噬形成时，胞浆型LC3会酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(PE)结合转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），这两种形式在正常细胞中都是存在的，而发生自噬的细胞中LC3-II会有明显的增加。 自噬主要是通过ULK complex磷酸化Beclin-1，激活脂酶VPS34，诱导了细胞自噬发生，因此可以通过ULK complex和Beclin-1的相关基因的抑制剂来抑制自噬的形成，包括的靶点有MAP kinases,JNK1,ERK和p38。同时，细胞自噬还涉及了多种信号通路，如哺乳动物雷帕霉素靶点mTOR信号通路，是依赖mTOR的相关信号通路形成自噬的重要途径。 另外，其它信号通路中，如3-甲基腺嘌呤（3-MA）可以通过抑制ClassⅢPI3K的活性抑制自噬；GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬；GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬；死亡相关蛋白激酶（death-associated protein linase,DAPK）和DAPK相关蛋白激酶（DAPK-related protein kinase-1,DRP-1）诱导自噬。PKA、casein激酶Ⅱ、MAP激酶、calcium途径也在自噬错综复杂的调控网格中，但其机制还不甚清楚。 【实验方法】 常用的观察和检测方法有∶ 1、透射电镜法 自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。
表-1自噬各阶段的形态学特征 2、荧光显微镜观察法 LC3全称MAP1LC3 ，贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记物。哺乳动物的LC3可分为三种：LC3A、LC3B和LC3C。其中，LC3B应用广泛。LC3蛋白合成后被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸残基，产生胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）相偶联，形成LC3-II并定位于自噬体内外膜上。自噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，产生LC3-I循环利用；内膜上的LC3-II被溶酶体酶降解，导致自噬溶酶体中LC3含量很低。因此，可以通过荧光显微镜观察内源性LC3或GFP-LC3，实现对自噬发生的检测。 3、Western Blot检测LC3和p62蛋白的表达量 ① 利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型LC3-I会酶解掉一小段多肽，随后跟PE结合转变为膜型的LC3-II。因此可以通过LC3-II/I比值的大小估计自噬水平的高低。 ② 除LC3外，其他自噬底物表达量的变化也可以用于监测自噬流。其中，p62是研究广泛的一个自噬底物。在自噬体形成过程中，p62作为链接LC3和聚泛素化蛋白之间的桥梁，被选择性地包裹进自噬体，之后被自噬溶酶体中的蛋白水解酶将其降解，所以p62蛋白的表达量与自噬活性呈现负相关。因此，利用Western Blot检测p62蛋白的表达量也可以评价自噬水平。 4、基于Keima蛋白的自噬评价 Keima是一种pH敏感型荧光蛋白，利用它在中性和酸性pH中荧光信号不同的特性，可以直观地反映自噬程度。将细胞质的Keima传递到溶酶体可反映非选择性自噬，将Keima融合到特定的蛋白(如融合到线粒体靶向序列—mt-Keima)可用于反映选择性自噬。值得注意是，基于keima的检测不能在固定细胞中进行，因为这种检测完全依赖于溶酶体的酸性。 |
