凋亡检测 (AnnexinV+PI)细胞凋亡检测（Annexin V-FITC+PI） AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。 碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 【应用简介】 AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。 碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 【实验原理】 正常细胞(活细胞)具有完好的细胞膜，此时细胞膜的组分之一——磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)位于细胞膜的内侧，当细胞发生凋亡时，细胞膜的结构发生改变，这使得原本在细胞膜内侧的PS外翻到细胞膜的表面，这种现象在凋亡的早期就会出现，因此就可以用与PS具有高亲和力、标记了荧光素的膜连蛋白V(Annexin V)来检测早期凋亡的细胞。 由于晚期凋亡和一些坏死的细胞也可以与Annexin V结合，因此需要引入另一种指标来将早期凋亡的细胞与之区分，这种指标就是细胞膜的通透性。与正常细胞和早期凋亡细胞不同，晚期凋亡及坏死细胞的膜通透性会增加，因此，一些原本不能进入到正常细胞内的核酸染料(如PI)便有机会进入细胞内与DNA结合。 所以，通过Annexin V和PI双染的方法，就可以把早期凋亡的细胞与晚期凋亡加坏死的细胞区分开来。 【实验方法】
【常见问题】 1、如果可以，尽量选择活力旺盛的“青年”细胞 细胞凋亡想做好，细胞状态选择最重要。 为什么要选择活力旺盛的细胞?大家都知道生长代数越靠前的细胞活力越旺盛，在条件容许的前提下，尽量选取传代次数较少的细胞。 为什么要选择“青年”的细胞?培养器皿中的细胞是一个微形群体。传代后，营养物质充裕，细胞群体中的“baby”细胞比较多。随着不断生长分裂，细胞数越来越多。当细胞融合度达到80%左右时，群体中的“青年”细胞的比例达到顶峰，此时的细胞状态最好，最适宜做凋亡实验。如果细胞继续培养，生存空间不足，营养物质匮乏，“老年”细胞逐渐变多，此时检测到细胞本身凋亡百分率就会很高。 2、过度消化会损伤细胞 流式检测的样本必须是单细胞悬液，对于贴壁培养的细胞，需要用胰酶降解细胞间结合处蛋白，使细胞相互分离。但胰酶是一把双刃剑，如果处理时间太长，也会损伤细胞。所以需要尽量去除延长消化时间的因素，比如，尽量去除清洗培养基的PBS，避免残留PBS稀释胰酶。当样本较多时，建议分组消化细胞，严格控制胰酶处理时间在1分钟内。 3、胰酶消化，加EDTA or not? EDTA螯合钙离子，影响Annexin V和细胞膜上的蛋白结合，因此许多凋亡试剂盒的protocol都特别标明，用于细胞凋亡实验的胰酶不能含有EDTA。从另一个方面讲，胰酶中加入EDTA，可以加快细胞从培养器皿上脱离的速度，避免胰酶长时间消化造成的细胞损伤。 胰酶中到底要不要加EDTA?是一个两难的选择? 其实，应该具体问题具体分析，有的细胞容易消化，当然用不含EDTA的胰酶。如果用胰酶消化几分钟后，大部分细胞仍然牢牢地吸附在培养器皿上，就建议选择含有EDTA的胰酶消化细胞，可以通过洗涤去除EDTA来保证Annexin V和细胞膜上的蛋白结合。 4、染色前或染色后的细胞可不可以固定? 当然不可以。如果你温习细胞凋亡检测的基本原理，就知道，固定会破坏细胞的完整性，使PI透过细胞膜进入细胞，提高细胞的凋亡百分率。所以，染色前和染色后的细胞都不可以固定，并且染色后的细胞需要在1小时内上流式检测。 5、表达GFP荧光的细胞是否可以使用此方法检测? 当然不可以。GFP和FITC都由488nm激光激发，二者发射光谱有极大的重叠。如果表达GFP荧光的细胞用此法检测细胞凋亡，FL1通道获得的荧光信号就是GFP和FITC的加和，不能真实地反应细胞凋亡的变化。所以，被检测细胞本身不能发出与FITC或者PI染料有光谱重叠的光。如果有，果断换用其他检测方法。 【注意事项】
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