Tunel检测
基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。
【应用简介】
基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。
【实验原理】
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。
【实验方法】
对于贴壁细胞或细胞涂片:
PBS或HBSS洗涤一次。
如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。
用4%多聚甲醛或免疫染色固定液固定细胞30-60分钟。
用PBS或HBSS洗涤一次。
加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。
用PBS洗涤2次.
滴加50μL TUNEL检测液，37ºC避光孵育60 min（孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发）。
PBS洗涤3次。
用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。
对于悬浮细胞或细胞悬液:
收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。
用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。
用PBS或HBSS洗涤一次。
用含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。
转步骤f。
对于石蜡切片:
二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。
滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。
PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
转步骤f。
对于冷冻切片:
用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。
PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。
加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。
转步骤f。
用待研基因shRNA慢病毒感染A549细胞，TUNEL染色，结果显示，shRNA下调目的基因表达后，凋亡细胞显著增多，表明待研基因与A549细胞凋亡显著相关。
【常见问题】
现象 | 可能原因 | 建议 |
非特异性染色 | TdT酶的浓度过高 | 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释 |
TdT酶反应时间过长或TdT酶反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。 | 注意控制反应时间，并确保TdT酶反应液能很好地覆盖样品。 |
光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂） | 尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂 |
在固定组织时样本DNA已断裂（内源核酸酶的作用） | 确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定 |
使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液 | 采用推荐的固定液 |
固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂 | 用含有dUTP和 dAPT的溶液封闭 |
标记率低 | 如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失） | 用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定或福尔马林或戊二醛固定。 |
固定时间过长，导致交联程度过高 | 减少固定时间，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定 |
荧光淬灭 | Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭，需注意避光操作 |
促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低 | 1、增加通透剂促渗时间；
2、增加通透剂的作用温度（15-25℃）；
3、优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间（如：以400ug/ml作用5min）；
4、0.1M的柠檬酸钠70℃作用30min。 |
荧光背景很高 | 支原体污染 | 请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染 |
TdT酶的浓度过高或反应时间过长 | 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释或注意控制反应时间 |
红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。
高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。 | 宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。 |
阳性对照没有信号 | DNase I工作液的浓度过低。 | 增加DNase I工作液浓度 |
组织样本从载玻片脱落 | 组织样本被酶从玻片消化下来 | 降低蛋白酶K的处理时间 |
【注意事项】
1.PBS清洗后，请尽量去除PBS液体再进行下一步反应；
2.避免载波片上的样本干燥造成实验失败。
