TUNEL染色

TUNEL染色

TUNEL染色可检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是标记（荧光或者生物素）的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3‘－OH末端，再通过荧光激发或者化学显色的方法，特异准确地检测发生凋亡的细胞，而正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。本实验适用于组织和细胞样本的凋亡原位检测。

【实验步骤】

      1 、细胞样品：自然晾干的细胞样品固定；封闭；通透液促渗

    冰冻样本：PBS浸润；封闭；通透液促渗

    石蜡样品：脱蜡及水化；微波或蛋白酶K修复；封闭

     2 、标记反应

    荧光标记：滴加TdT酶反应液，反应；荧光显微镜检测

    生物素标记：滴加TdT酶工作液反应；滴加Streptavidin-HRP工作液反应；DAB显色；苏木素复染；显微镜观察拍照

【实验细节】

     1、脱蜡和水化

   脱蜡可以先 60ºC 20 min，再用使用二甲苯两次 5-10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀。

     2、细胞通透

   一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用 10-30 min，几 μm 切片用短时间；几十 μm 切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

     3、TUNEL 反应液的时间

   一般是37ºC 1 h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至 2 h，但要结合你最终的背景着色。

     4、DAB显色条件的选择

   一般 DAB 反应10 min 左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过 30 min；promega 公司提供的 DAB 液（桃红色）。

     5、PBS的充分清洗

   在 TUNEL 反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达 5 次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。