免疫荧光IF

免疫荧光IF

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

【应用简介】

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

【实验原理】

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

【实验步骤】

   细胞准备：对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

   固定：根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min.

   通透：使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.

   封闭：使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.

   一抗结合：室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min.

   二抗结合：间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

   封片及检测：滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

【实验流程示意图】

【常见问题】

1、无/弱染色

    烤片温度过高，推荐56℃-60℃1-2h；

    一抗是否适用固定液和石蜡切片，使用浓度是否过低，孵育是否时间过短等。

2、非特异性背景染色

    是否灭活内源性过氧化物酶；

    孵育过程中干片；

    抗原热修复过度。

3、染色过深

    一抗浓度过高；

    染色试剂浓度过高或孵育时间过长。

【注意事项】

1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，荧光可能会淬灭。

2、实验对照设置越多，结果越可信。

[送检与交付标准]