IP/CO-IP免疫沉淀是用于抗原检测和纯化的最广泛使用的方法之一。免疫沉淀(IP)的原理为:针对特定靶蛋白的抗体与样品(细胞裂解物等)中的靶蛋白形成免疫复合物,随后利用Protein A-磁珠或Protein G-磁珠将该免疫复合物从混合物中沉淀下来。最后将靶蛋白从磁珠上洗脱(如果抗体没有共价连接到磁珠上或使用变性缓冲液进行洗脱,抗体也会被洗脱下来),并通过SDS-PAGE,Western Blot等手段对洗脱下来的蛋白进行分析。 Co-IP是免疫沉淀的延伸,主要用于蛋白-蛋白相互作用检测。Co-IP的原理是基于IP反应捕获和纯化靶蛋白,如果样品溶液中存在与靶蛋白相互作用的目的蛋白,也会被一同捕获及纯化得到,随后利用SDS-PAGE,Western Blot等手段对得到的目标蛋白进行分析(查看详细Co-IP实验原理)。 两者之间的差距,主要是IP专注于结合抗体的主要靶标(Co-IP中的诱饵蛋白),而Co-IP则是靶向次要靶标(与诱饵蛋白互作的蛋白)。免疫共沉淀得到的是诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物,可以用于检测和鉴定天然状态蛋白质之间的相互作用。 免疫共沉淀优缺点: 优点 (1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态; (2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响; (3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 缺点 (1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用; (2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用; (3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。 (4)灵敏度没有亲和色谱高 |