搜索
全国服务热线 020-31100174



Western Blot

Western免疫印迹,是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

SouthernNorthern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,探针是抗体,显色用标记的二抗。


经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。


注意事项:

1.   一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。

2.   显色液必须新鲜配置使用,最后加入H2O2

3.   DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细。


免疫反应

1.   0.01 M PBS洗膜,5 min × 3次。

2.   加入包被液,平稳摇动,室温2 h

3.   弃包被液,用0.01 M PBS洗膜,5 min × 3次。

4.   加入一抗(按合适稀释比例用0.01 M PBS稀释,液体必须覆盖膜的全部),4℃ 放置12 h以上。阴性对照,以1%BSA取代一抗,其余步骤与实验组相同。

5.   弃一抗和1%BSA,用0.01 M PBS分别洗膜,5 min×4次。

6.   加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01 M   PBS稀释),平稳摇动,室温2 h

7.   弃二抗,用0.01 M PBS洗膜,5 min×4次。

8.   加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。


分享到:
初源云医疗
初源云医疗专注于医学科研版块,业务涵盖细胞基因修饰、病毒包装、合成生物学、单细胞测序、蛋白质组学、基因编辑动物、药品上市后药效研究等科研技术服务和成果转化。 基石启航医疗与香港基石生物、探罕科学研究有限公司、松诺生物及香港科技大学、沈阳医学院等国内外知名机构有着深度合作关系,旨在促进资源共享和技术交流,加速研究成果的转化和应用
资讯与资源
新媒体矩阵
合作伙伴