甲基化测序甲基化测序 DNA甲基化就是在DNA甲基化转移酶(DNMT)的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5′-甲基胞嘧啶的过程。DNA甲基化是发现的基因表观修饰方式之一，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育和肿瘤发生发展中起着重要作用，是目前及未来很长一段时间的研究热点之一。 （1）全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS） 全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的方法。 常规全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。 技术优势： 应用范围广：适用于人和大多数动植物研究（参考基因组已知）。 全基因组覆盖：大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱。 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。 （2）精准DNA甲基化和羟甲基化测序（oxBS-seq） DNA羟甲基化是近年发现的一种新的DNA修饰并迅速成为研究热点。随着研究的深入，发现之前被认为是检测DNA甲基化“金标准”的重亚硫酸盐测序并不能区分DNA甲基化（5mC）和DNA羟甲基化（5hmC）。易基因联合剑桥大学建立了化学氧化法结合重亚硫酸盐转化的测序技术（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），该技术不仅可以精确检测DNA甲基化，排除DNA羟甲基化的影响，还可以双文库结合同时单碱基分辨率精确检测DNA羟甲基化。 技术原理： oxBS-Seq将5hmC氧化5fC，后者可以被Bisulfite转为U，从而实现5mC的精准检测；同时，经过与常规Bisulfite结果比较可以实现对5hmC的准确检测。 技术优势： DNA甲基化检测全新的“金标准” 全基因组单碱基检测DNA羟甲基化修饰 多重标准验证高氧化效率和高Bisulfite转换率 实验偏好性低，重复性高（R²>0.98） 可满足多种测序应用需求：简化基因组氧化甲基化测序（oxRRBS），目标区域氧化甲基化测序（Target-oxBS）。 （3）简化甲基化测序（RRBS/dRRBS/XRBS） 简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。为了适应科研技术的需要，我们进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。 为助力低样本量多维度分析，我们开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向测序方法：extend-ed-representation bisulfite sequencing（XRBS），实现了高灵敏度和样本复用，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞。 技术优势： 精确度高：在其覆盖范围内可达到单碱基分辨率。 重复性好：多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%，适用于多样本间的差异分析。 性价比高：测序区域针对高CpG区域，数据利用率更高。" （4）单/微量细胞全基因组甲基化测序（scWGBS） 单细胞及微量样本的DNA甲基化组学研究很大程度上受制于建库测序技术。传统的文库构建方法或类似于基因组DNA的单细胞扩增技术很难应用到甲基化实验过程中。易基因建立了基于线性扩增和单管建库的技术，可充分降低文库偏好性，准确的完成珍贵样本的全基因组甲基化研究。 单细胞及微量珍稀样本的甲基化研究主要应用于肿瘤发生机制，癌症研究，胚胎植入前诊断，胚胎早期发育，生殖细胞重组，干细胞及细胞异质性等研究领域。应用的样本包括单细胞、微量细胞等。 技术优势： 超低起始量：单细胞或超低的建库DNA起始量 测序覆盖度高：大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态 （5）扩增子（羟）甲基化测序 扩增子（羟）甲基化技术针对基因组上特定的DNA序列设计甲基化特异性扩增引物（如感兴趣的基因等），基因组DNA进行（氧化）重亚硫酸盐处理后，PCR扩增检测片段，扩增产物通过二代高通量测序，更精准的检测基因区域的甲基化状态。 技术优势 准确性高：可满足几个到上百个基因/CpG 位点的检测，其覆盖范围内可达到单碱基分辨率，覆盖深度超高（位点平均覆盖深度>300X）。 性价比高：低成本、周期短，超高性价比。 针对性强：适用于特定基因或者位点甲基化状态的检测。 应用广泛：广泛用于临床样本多位点的甲基化Biomarker 筛选、验证及临床转化应用。 （6）（羟）甲基化DNA免疫共沉淀测序(h)MeDIP-seq 5hmC是新发现的一种的修饰碱基，由TET家族的酶通过氧化5mC产生的。5hmC不仅能够降低MeCP蛋白的甲基化结合结构域(MBD) 与甲基化DNA的亲和性，具有潜在的参与基因表达调控的转录调节功能，而且参与了DNA去甲基化过程。 羟甲基化DNA免疫沉淀测序（Hydroxymethylated DNA Immunoprecipitation Sequencing，hMeDIP-Seq）是通过运用5'-羟甲基胞嘧啶特异性抗体富集羟甲基化的DNA 段，然后结合高通量测序技术在全基因组水平上以较小的数据量，快速、高效地寻找羟甲基化区域。可广泛应用于羟甲基化与疾病关系研究以及羟甲基化在胚胎发育过程中的研究。 技术优势： 检测范围广：全基因组范围鉴定甲基化修饰区域。 针对性强：针对性检测基因组内具有甲基化修饰的区域。 成本低：大大降低了测序数据量，测序成本低。 |
