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RIP检测

RIP检测

       核酸和蛋白质是组成生命的主要物质,研究细胞内RNA与蛋白结合情况,可以了解转录后调控网络的动态过程,帮助我们发现的miRNA的调节靶点,RIP检测实验是应用于蛋白与RNA互作关系的重要参考。


【应用简介】

       核酸和蛋白质是组成生命的主要物质,研究细胞内RNA与蛋白结合情况,可以了解转录后调控网络的动态过程,帮助我们发现的miRNA的调节靶点,RIP检测实验是应用于蛋白与RNA互作关系的重要参考。


【实验原理】

       RIP实验研究的是RNA-蛋白之间的相互作用,运用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白,通过免疫学方法将RNA-蛋白复合物一起分离出来,通过对目的片段的纯化与检测,从而分析蛋白质和RNA相互作用的信息。


【实验方法】

第一步:细胞裂解液的制备

第二步:磁珠与抗体的准备

第三步:RNA结合蛋白免疫沉淀

第四步:用蛋白酶ķRNA-蛋白复合物进行消化

第五步:RNA纯化

第六步:对结合在复合物上的RNA反转录,合成cDNA

第七步:Q-PCR验证RNA


技术总结

【常见问题】

1、经过免疫沉淀后的RNA浓度过低;

2、Input组目的条带无扩增;

3、RNA纯度未在1.8-2.1之间;

4、阴性对照IgG反应中有目的条带。

【注意事项】

1、RIP反应体系中的试剂和抗体中均需保证无RNA酶;

2、细胞样本的数量较大,应按照所需要求提供细胞样本数量;

3、选购的相应的抗体应达到IP实验级别,并通过阴性实验反馈结果可信性。


送检与交付标准

样品类型

样品需求

保存条件

运输条件

备注

动物组织

单个样品>0.1g,2mlEP管或冻存管装,不要过量;样本应尽量新鲜,如不能立即提取蛋白或核酸,应液氮速冻后冻存于-80℃或更低,冻存样本避免反复冻融以致降解

-80

干冰

所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识

种子样本

去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本,单个样品>0.2g。

-80

干冰

贴壁/悬浮细胞

1. 总RNA或蛋白:106cell/指标、浆/核RNA或蛋白:107cell/指标、线粒体RNA或蛋白:2*107cell/指标,样本尽量新鲜,细胞收取后直接加Trizol(QPCR检测)或直接冻存于-80℃。

2. 若细胞处理(加药、转染、感染)后状态差应酌情加大收样量。

-80

干冰

全血/血清样品

用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。

-80

干冰

石蜡包埋样品

由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块,有效厚度大于 0.1cm; 新鲜的 FFPE 组织切片,每片厚度不超过 10μm,2~8 张,表面积不超过 250mm2

-20

冰袋

抗体

1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体;

2. 按抗体说明书要求寄送,尽量避免分装;如分装,确保量足够进行实验,并提供抗体说明书。

3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,抗体的量应大于实验所需的量。

-20

冰袋

引物

干粉,≥1OD,如进行预实验,每个基因至少提供两对引物, 附带公司引物合成单。

-20

冰袋或常温

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初源云医疗专注于医学科研版块,业务涵盖细胞基因修饰、病毒包装、合成生物学、单细胞测序、蛋白质组学、基因编辑动物、药品上市后药效研究等科研技术服务和成果转化。 基石启航医疗与香港基石生物、探罕科学研究有限公司、松诺生物及香港科技大学、沈阳医学院等国内外知名机构有着深度合作关系,旨在促进资源共享和技术交流,加速研究成果的转化和应用
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