IF16.6 Nature Communications│泛素化连接酶CHFR通过泛素化降解VE-cadherin破坏内皮细胞间的粘附连接IF16.6 Nature Communications│泛素化连接酶CHFR通过泛素化降解VE-cadherin破坏内皮细胞间的粘附连接 一、前言 2023年10月18日，伊利诺伊大学医学院Chinnaswamy Tiruppathi研究小组在Nature Communications上发表了题为“Ubiquitin ligase CHFR mediated degradation of VE-cadherin through ubiquitylation disrupts endothelial adherens junctions”的研究论文，研究发现内皮细胞表达的E3连接酶CHFR在调节VE - cadherin的表达，从而调节内皮连接屏障完整性中的必要作用。
二、背景介绍 最常见的泛素化形式包括形成K48连接的多聚泛素链，通过激活蛋白酶体途径诱导蛋白质降解和形成K63连接的多聚泛素链，对蛋白质的信号传导和运输非常重要。E3连接酶在介导靶蛋白的泛素化过程中具有特异性。人类基因组编码600个E3连接酶；然而，在血管炎症过程中，特异性E3连接酶是否介导VE - cadherin的泛素化和降解尚不清楚。 三、图文解析
图1 要点1： a.使用AVM BIOMED Snapshot蛋白组学微阵列系统来鉴定VE-cadherin相互作用蛋白，如工作流程所示。该微阵列包含21065个固定在硝酸纤维素膜网格上的人类重组蛋白。鉴定了可溶性C末端绿色荧光蛋白(GFP)标记的hVE-cadherin与微阵列中的蛋白质的结合。 b.与其他蛋白相比，CHFR与VE-cadherin的平均结合信号最强。 c.CHFR是与VE-cadherin相互作用最显著的E3连接酶。 d-e.为了确定CHFR和VE-cadherin之间的相互作用，构建了N端融合GFP的野生型CHFR(WT-CHFR)和CHFR突变体，并将其转染到内皮细胞系(HMEC)中。缺失FHA(ΔFHACHFR)或PBZ(ΔPBZ-CHFR)结构域的CHFR表达量显著降低，而缺失RF结构域(ΔRF-CHFR)的CHFR表达量升高，表明RF结构域在介导CHFR29的自泛素化降解过程中发挥关键作用。 f.使用anti-GFP琼脂糖珠pull-down实验来评估CHFR与VE-cadherin的结合。观察到VE-cadherin与缺乏CR(ΔCR-CHFR)或RF(ΔRF-CHFR)结构域的CHFR突变体的结合显著减少。缺失FHA结构域的CHFR(ΔFHA-CHFR)与VE-cadherin的结合比WT-CHFR增加了2倍，而缺失PBZ结构域的CHFR(ΔPBZ-CHFR)与VE-cadherin的结合比WT-CHFR增加了数倍。 g-h.为了确定CHFR在泛素化VE-cadherin中的作用。使用单独转染带有HA标签的泛素(HA-Ub)或带有CHFR表达质粒的HEK293细胞(不表达VE-cadherin)，然后用表达C端GFP标签的小鼠VE-cadherin的腺病毒感染细胞。在同时表达HA-Ub、VE-cadherin和WT-CHFR的细胞中，可以看到K48连接的VE-cadherin泛素化，而不是K63连接的VE-cadherin泛素化。在单独表达VE-cadherin或HA-Ub的细胞中，没有观察到VE-cadherin的K48泛素化。在表达ΔRF-CHFR或ΔFHA-CHFR与HA-Ub和VE-cadherin的细胞中观察到VE-cadherin的泛素化缺陷，表明CHFR和RF的重要作用介导VE-cadherin结合和泛素化的FHA结构域。
图2 要点2： a.使用原代人肺微血管内皮细胞(HLMVEC)，其中CHFR的表达被siRNA以浓度依赖的方式抑制。 b.在对照的HLMVEC中，VE-cadherin的表达随着LPS刺激时间的延长而降低，并在24小时后恢复，而在CHFR敲低的HLMVEC中，LPS对VE-cadherin的表达没有影响，这与CHFR在泛素化VE-cadherin中的关键作用一致。 c.确定了CHFR通过K48连接的多聚泛素链介导的VE-cadherin泛素化在诱导内皮AJs破坏中的作用。CHFR敲低通过K48-poly-Ub链阻止基线和LPS诱导的VE-cadherin泛素化。还确定了在对照组和CHFR敲低的HLMVEC中VE-cadherin通过K63连接的多聚泛素链的泛素化，相反，在对照组和CHFR敲低的HLMVEC中，无论是否有LPS刺激，VE-cadherin通过K63连接的多聚泛素链的泛素化均未见到。 d.CHFR敲低也阻止了LPS诱导的AJs处VE-cadherin表达的下调。 e-f.观察到CHFR敲除阻止了LPS和蛋白酶激活受体1(PAR-1)诱导的内皮通透性的增加。 g.通过免疫染色表达发现HLMVEC中CHFR在胞浆、胞核和AJs的表达与VE-cadherin共定位。LPS刺激(已知破坏VE-cadherin连接)后，在AJs附近与VE-cadherin共定位的内吞囊泡中也发现了CHFR。
图3 要点3： a.ChfrΔEC小鼠肺EC中CHFR蛋白表达明显缺失。 b-c.利用肺组织测定肺EC中VE-cadherin的表达，观察到与WT相比，ChfrΔEC小鼠中VE-cadherin的表达增加了3倍以上。 d-e.观察到ChfrΔEC小鼠中VE-cadherin相互作用蛋白VE-PTP，P120连环蛋白和β-catenin以及紧密连接蛋白claudin-5的表达增加。 f.LPS刺激导致WT小鼠VE-cadherin表达在6小时内丢失，在LPS刺激后24小时表达恢复到基线水平。相反，LPS刺激对ChfrΔEC小鼠中VE-cadherin的表达没有影响，表明EC表达的Chfr通过泛素化介导VE-cadherin对LPS的降解。 g.WT小鼠在基础状态和LPS刺激后，VE-cadherin被K48连接的多聚泛素链泛素化。相反，在ChfrΔEC小鼠中，基础状态和LPS诱导的VE-cadherin通过K48连接的多聚泛素链泛素化均被取消。观察到在ChfrΔEC小鼠中，VE-cadherin通过K63连接的poly-Ub链的泛素化可以忽略不计，这表明VE-cadherin的降解机制中缺乏K63连接的poly-Ub的参与。重要的是，观察到VE-cadherin的表达和VE-cadherin通过K48连接的多聚泛素链的泛素化之间的反比关系，表明Chfr通过K48连接的多聚泛素链介导VE-cadherin的泛素化在介导VE-cadherin降解中的重要作用。
图4 要点4： a.LPS刺激后，WT和ChfrΔEC小鼠肺组织病理学检查显示，ChfrΔEC小鼠肺组织中炎性PMN浸润明显减少。 b.研究人员还观察到，与WT小鼠相比，ChfrΔEC小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量和中性粒细胞浸润数量减少，MPO活性降低。c-d.与WT小鼠相比，ChfrΔEC小鼠中LPS诱导的PMN渗出入肺和肺血管通透性显著降低。e-f.与WT相比，用LPS刺激和盲肠结扎穿刺严重的混合微生物脓毒症(CLP)模型的Chfr Δ EC小鼠的死亡率降低。
图5 要点5： a.研究人员观察到PA感染诱导的肺血管高通透性在ChfrΔEC小鼠中显著降低。 b.WT小鼠显示PMN向组织的迁移增加；然而，在ChfrΔEC小鼠中，PMN跨膜迁移显著减少，PMN的血管聚集增加，这与这些小鼠内皮连接屏障的维持相一致。 c.然而，在基础状态下，ChfrΔEC和WT小鼠的血管外组织中均未观察到明显数量的PMN。WT小鼠在PA剂量为106PFU/只的3天内死亡率为40%，而在ChfrΔEC小鼠中没有观察到死亡率。此外，使用致死模型观察到WT小鼠在24小时内100%死亡，而在ChfrΔEC小鼠中仅在相同时间内观察到60%死亡。重要的是，20%的ChfrΔEC小鼠在PA致死剂量后存活长达10天。
图6 要点6： a.为了研究CHFR表达的转录机制，分析了编码CHFR的小鼠和人类基因的5′-调控区，并观察到转录因子FoxO1和NF-κB的多个结合位点。通过启动子序列分析，确定了FoxO1是NF-κB的一个靶基因，因此重点研究了FoxO1在调节CHFR表达中的核心作用。 b-c.观察到WT小鼠在LPS刺激后6小时FoxO1 mRNA和蛋白表达最高。d.在LPS刺激下，FoxO1与近端FoxO1结合位点(-447、-187)的相互作用很小，而在mChfr启动子的-578、-566和-495位点，FoxO1与FoxO1结合增加了数百倍。 e-f.由于LPS刺激引起了WT中CHFR mRNA和蛋白表达的时间依赖性增加，确定了FoxO1是否负责Chfr的表达。 g.体内给予AS184285显著降低LPS诱导的CHFR表达，而NF-κB依赖的ICAM-1表达不受影响。 h-i.与非ARDS对照相比，非存活ARDS患者肺ECs中CHFR和FoxO1的表达均增加。
图7 要点7： a.为了确定EC表达的FoxO1在调节CHFR表达进而影响血管屏障完整性中的作用，利用Cre依赖的Cas9敲入小鼠模型，在成年小鼠EC中敲除FoxO1。 b-c.用两个不同的sgRNA(FoxO1-sgRNA-1;FoxO1-sgRNA-2)靶向mFoxO1或一个乱序sgRNA(Sc-sgRNA)作为对照。编码mFoxO1-sgRNA-1的质粒干扰了肺ECs中FoxO1的表达。 d-f.LPS刺激增加了WT(Sc-sgRNA处理)小鼠中FoxO1和CHFR的表达，而LPS没有改变FoxO1-sgRNA-1(FoxO1ΔEC)小鼠中FoxO1和CHFR的表达，并且诱导了VE-cadherin的降解。在对照实验中，观察到FoxO1ΔEC小鼠表现出对FoxO1靶基因血管生成素2(Ang-2)表达的抑制。 g.与此结果一致，在FoxO1ΔEC小鼠中，LPS不能通过K48连接的多聚Ub链泛素化VE-cadherin。 h.评估了LPS诱导的FoxO1ΔEC小鼠内皮屏障的破坏。在FoxO1ΔEC小鼠中，LPS诱导的肺血管通透性增加被消除。 i.与此相一致，与WT小鼠相比，FoxO1ΔEC小鼠CLP诱导的死亡率也显著降低。 j.这些结果共同表明，FoxO1介导的CHFR表达通过降解VE-cadherin和开放内皮连接屏障诱导内皮细胞屏障破坏。 本文小结 综上所述，本研究证明了在小鼠内皮细胞中敲除CHFR增强了VE-cadherin连接的完整性，并阻止了LPS、TNF-α和凝血酶等炎症介质对AJs的破坏。与非ARDS对照组相比，CHFR和FoxO1在非存活ARDS患者肺内皮细胞中的表达均增加数倍。在假单胞菌感染的小鼠中的研究表明，FoxO1和CHFR在内皮细胞中的不受限制的表达可能是炎症性疾病发病机制的关键。因此，内皮细胞表达的泛素E3连接酶CHFR介导的VE-cadherin降解在内皮屏障破坏机制中至关重要，从而在血管炎症的发生中发挥作用。 参考文献：Tiruppathi C, Wang DM, Ansari MO, Bano S, Tsukasaki Y, Mukhopadhyay A, Joshi JC, Loch C, Niessen HWM, Malik AB. Ubiquitin ligase CHFR mediated degradation of VE-cadherin through ubiquitylation disrupts endothelial adherens junctions. Nat Commun. 2023 Oct 18;14(1):6582. https://doi.org/10.1038/s41467-023-42225-2. |
