IF 16.6 Nature Communications│CD44在血管内皮中连接自噬下降和衰老IF 16.6 Nature Communications│CD44在血管内皮中连接自噬下降和衰老 ★ 前言 ★ 2023年9月8日，河南工业大学生物工程学院，在Nature Communications上发表题为“CD44 connects autophagy decline and ageing in the vascular endothelium”的研究论文。该研究表明一种由CD44功能协调的桥接自噬下降和衰老的机制。
01 背景介绍 内皮细胞是血管的重要组成部分，处于循环血液与组织的交界面，在维持机体生理功能方面发挥着许多重要作用。血管内皮细胞(VEC)衰老是血管系统衰老的标志，它使个体易于发生各种心血管疾病(CVDs)。提高对内皮衰老的认识对于制定有效的策略以降低CVD风险和维持长期健康至关重要。自噬是一种对细胞稳态至关重要的管家机制。一些证据表明，内皮自噬随着年龄的增长而下降，而作用于自噬激活的干预措施逆转了动脉衰老，改善了与年龄相关的内皮功能障碍，建立了内皮衰老与自噬下降之间的因果联系。然而，目前关于年龄相关的内皮自噬下降的详细分子基础尚不清楚，导致临床干预缺乏潜在的靶点。 02 图文解析
要点1： a-c.在体外连续传代HUVECs以诱导复制性衰老。SA-β-gal活性和细胞衰老标志物CDKN1A(p21)和CDKN2A(p16)的表达随着传代次数的增加而增加。人脐静脉内皮细胞(HUVECs)在复制性衰老后，CD44在mRNA和蛋白水平的表达均增加。 d-e.为了研究体内自然衰老过程中血管内皮细胞CD44表达水平的变化，分离了青年、中年和老年C57BL/6小鼠的主动脉，并检测了CD44的表达水平。qRT-PCR和western blot结果显示，C57BL/6小鼠主动脉中CD44的表达水平随着年龄的增加而增加。 f-g.在老年小鼠主动脉内皮中检测到CD44的强免疫反应性，但在年轻动物中未检测到CD44的强免疫反应性，这与之前在大鼠中的观察结果一致，表明内皮CD44在衰老过程中上调。 h-i.为了评估CD44在VEC衰老中的潜在作用，用Lenti-shCD44转染HUVECs以敲低CD44。在群体倍增期(PD)14~PD18，与非靶向对照细胞相比，这些细胞表现出较低的SA-β-gal活性和较低的CDKN1A和CDKN2A水平。 j-k.CD44基因发生选择性剪接，产生标准CD44(CD44s)和变异型CD44(CD44v)异构体。CD44s由恒定的外显子编码，在癌症和正常组织中广泛表达，而CD44v与CD44s不同的是插入了变异的外显子，其分布更受限制。在PD3-PD6，过表达CD44s(HUVECs17表达的唯一亚型)诱导年轻HUVECs早衰。 l-n.在一组老年小鼠中，CD44基因敲除(CD44-KO)小鼠的血管内皮衰老标志物显著低于野生型(WT)小鼠。 o-q.与年轻小鼠相比，在老年WT小鼠中观察到年龄介导的动脉结构变化，表现为主动脉壁厚度增加，主动脉弹性片结构完整性丧失，胶原含量增加。在CD44-KO小鼠中，这些血管壁的年龄依赖性改变似乎得到了改善。r-s.血管内皮细胞衰老的一个共同特征是内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活性和一氧化氮(nitric oxide，NO)水平降低。老年CD44-KO小鼠主动脉内皮磷酸化eNOS(p-eNOS)表达和血清NO水平高于老年WT小鼠。
要点2： a-b.CQ未诱导老年WT小鼠主动脉内皮细胞LC3B puncta数量或SQSTM1(自噬的一个特征明确的底物)积累的显著变化，与预测的自噬能力随年龄增长而下降一致。相反，CQ增加了老年CD44-KO小鼠内皮中LC3B点状聚集的数量和SQSTM1的积累，表明敲除CD44减弱了VEC中与年龄相关的自噬下降。 c-d.在培养的HUVECs中转染靶向CD44的特异性siRNA，检测细胞自噬。CD44的敲低增加了HUVECs中内源性LC3B puncta的数量和LC3B-II水平，并且这些增加在自噬抑制剂巴弗洛霉素A1的存在下进一步增强，表明完整的自噬流。同时，CD44敲低导致自噬底物SQSTM1的显著降解。 e.与此一致，通过点状双荧光mCherry-GFP-LC3B表达观察到CD44沉默的HUVECs中自噬体(黄色点)和自噬溶酶体(仅红色点)数量均增加。 f.超微结构分析显示，CD44沉默的HUVECs中存在大量新月形吞噬体，支持CD44缺失增强VECs基础自噬的概念。 g-h.相反，CD44过表达的HUVECs中LC3B puncta的数量减少，LC3B-II的水平降低，SQSTM1的明显积累，而巴弗洛霉素A1没有改变这种变化，表明CD44过表达降低自噬活性而不是促进自噬体降解。 i-j.此外，与对照细胞相比，过表达CD44的HUVECs中自噬小体和自噬溶酶体的数量均减少，共同证明CD44降低了VECs中的自噬。
要点3： a.构建了缺失ICD(CD44ΔICD)、ECD(CD44ΔECD)、ECD+TMD(CD44ICD)或ICD+TMD(CD44ECD)的CD44缺失突变体。 b-d.发现CD44ECD或CD44 ΔICD并没有降低HUVECs中LC3B-II水平或自噬体样结构，也没有诱导SQSTM1的积累，而CD44ICD或CD44 Δ ECD在降低自噬方面表现出与全长CD44相似的作用。 e.过表达CD44ICD的HUVECs中自噬小体和自噬溶酶体的数量均减少。 f.巴弗洛霉素A1处理显示CD44ICD过表达的HUVECs中自噬水平显著降低。 g.为了进一步证明CD44ICD的作用，利用CRISPR/Cas9系统构建了CD44-KO HUVECs。CD44-KO细胞的基础自噬水平高于对照细胞，而这种增加被全长CD44s或CD44ICD的重组完全挽救，证实CD44通过其ICD降低自噬。 h.为了将这些观察扩展到体内情况，将R26em CD44ICD-KI小鼠(CD44ICDflox/flox,B6J.Cg-Gt(ROSA)26Sorem16(CAG-CD44ICD)/J与内皮特异性Tek-Cre小鼠(B6.Cg-Tg(Tek-Cre)12Flv/J)。 i-j.与同窝对照小鼠(CD44ICDflox/flox,以下记为WT小鼠)相比，CD44ICDEC-KI小鼠主动脉内皮中LC3斑点数量减少，SQSTM1水平增加。 k.CQ没有明显增加CD44ICDEC-KI小鼠主动脉中LC3B-II的蓄积。CD44ICDEC-KI小鼠主动脉中SQSTM1的水平高于WT小鼠。
要点4： a-c.CD44在γ -分泌酶的作用下发生膜内蛋白水解，导致CD44ICD片段的释放。为了确定CD44ICD的释放是否为自噬抑制所必需，通过消除CD44胞内剪切所必需的4个氨基酸( I287-N290 )，构建了胞内剪切位点缺失突变体( CD44Δ287-290 )。与全长CD44不同，CD44 Δ 287-290不能降低HUVECs的自噬。 d.抑制CD44ICD释放的γ -分泌酶抑制剂24 -二氨基- 5-苯基噻唑- ( DAPT、GSI)逆转了CD44对自噬的抑制作用，但不改变CD44ICD对自噬的抑制作用，证实CD44ICD的释放是减少自噬所必需的。 e-g.为了证实这一点，将豆蔻酰化序列( MGSSKSKPK )添加到CD44ICD的N端( Myr-CD44ICD )，使其不能转位到细胞核23。Myr-CD44ICD也降低了HUVECs的自噬，表明CD44ICD在调节VEC自噬中的作用是不依赖于核转位的。
要点5： a-d.敲低CD44增加PIK3R4和PIK3C3的水平，而过表达CD44或CD44ICD降低它们的水平。BECN1，Atg14L和UVRAG的蛋白水平不随CD44或CD44ICD的变化而变化。 e.此外，基于ELISA的体外激酶反应显示，与对照细胞相比，CD44或CD44ICD过表达后PtdIns3K激酶活性显著降低，表明CD44降低了PtdIns3K复合物的水平和活性。
要点6： a.通过荧光显微镜得到了证实，表明在VECs中CD44ICD过表达导致PIK3C3和PIK3R4从PtdIns3K复合物中丢失。 b.通过酵母双杂交实验，发现CD44ICD可以直接与STAT3相互作用，但不能与Ptd Ins3K复合物的所有核心组分相互作用。STAT3与Ptd Ins3K复合物的核心成分CD44ICD和PIK3R4直接相互作用。 c-e.通过双分子荧光互补(BiFC)和pull-down实验证实了CD44ICD与STAT3和STAT3与PIK3R4之间的直接相互作用。 f.此外，使用Alphafold2构建了STAT3和CD44ICD模型，然后使用GRAMM-X和PDBePISA服务器对蛋白-蛋白结合模式进行了研究和分析。STAT3-CD44ICD复合物的亲和能为-7.2 kcal/mol，表明这些蛋白结合紧密。STAT3-CD44ICD复合物的结合稳定性是由CD44ICD的N端35个氨基酸支持的，这些氨基酸在STAT3和CD44ICD之间形成了多个氢键。 g.在Co-IP分析中，N端缺失35个氨基酸的CD44ICD(CD44ICD_ ΔN35)不能结合STAT3、PIK3R4和PIK3C3，说明这35个氨基酸是CD44ICD与STAT3结合所必需的。h.CD44ICD通过直接与STAT3相互作用，降低PtdIns3K复合物的水平和活性，并与PIK3R4和PIK3C3结合，从而破坏PtdIns3K复合物的形成，导致自噬减少。
a-c.衰老标记物，包括SA-β-gal染色和CDKN1A和CDKN2A水平，在8-10月龄CD44ICDEC-KI小鼠主动脉内皮中显著高于同龄对照动物。 d-f.CD44ICDEC-KI小鼠表现出与年龄相关的主动脉组织学变化，而在WT小鼠中没有观察到。 g-i.与WT小鼠相比，CD44ICDEC-KI小鼠主动脉在收缩期和舒张期的管腔直径较小，主动脉弓处的血流速度增加。 j-k.与体内结果一致，在CD44ICD过表达的HUVECs中观察到SA-β-gal染色增强和CDKN1A和CDKN2A水平增强。
要点8： a.GFP：：LGG-1在取食表达L4440载体的细菌的DA2123线虫中呈弥散分布，偶见点状结构，而GFP：：LGG-1在取食表达针对clec-31的dsRNA的细菌的DA2123线虫中形成大量点状结构，表明clec-31调控自噬。 b-c.敲低clec-31诱导了一系列在自噬过程中具有不同功能的基因的表达，而过表达clec- 31(clec-31OE)则抑制了它们的表达。 d.为了探究clec-31是否参与衰老的调控，检测了不同年龄秀丽隐杆线虫中clec - 31的水平，发现随着年龄的增长，clec-31的表达量增加。 e-h.敲低clec-3显著延长了线虫的寿命，改善了与年龄相关的身体弯曲率、咽泵率和运动活性的下降，减少了脂褐素的沉积。 i-l.相比之下，过表达clec-31缩短了线虫的寿命，并加速了线虫年龄相关的退行性变化。
要点9： a-d.通过饲喂表达m TOR / let - 363 ds RNA的细菌激活cle -31-OE线虫的自噬，逆转clec-31-OE线虫:的寿命缩短和年龄相关表型。e-h. 在雷帕霉素处理的clec-31-OE线虫中也得到了类似的结果。i - k.通过对unc-51或vps34进行RNAi抑制自噬，抑制clec-31-KD线虫和雷帕霉素处理clec-31-OE线虫的寿命延长。 全文小结 综上所述，研究证明了VECs中CD44的水平随着年龄的增长而增加，这降低了PtdIns3K复合物的核心成分PIK3R4和PIK3C3的水平，并抑制了PIK3C3激酶的活性。此外，CD44ICD通过结合和激活STAT3结合PIK3R4和PIK3C3。因此，PIK3R4和PIK3C3在PtdIns3K复合体中丢失，导致VECs自噬下降和衰老。此外，证明了自噬激活抑制过表达CD44ICD的VECs的过早衰老，该功能在秀丽隐杆线虫的CD44同系物 clec-31中保守。该研究为自噬和血管内皮细胞老化之间的直接联系提供了明确的证据和分子基础。这些观察结果揭示了CD44在自噬和衰老中的功能，并表明它是延缓血管衰老的潜在靶点。 参考文献：Zhang, L., Yang, P., Chen, J. et al. CD44 connects autophagy decline and ageing in the vascular endothelium. Nat Commun 14, 5524 (2023). |
