IF16.6 Nature Communications│泛素连接酶CHFR通过泛素化降解VE-cadherin破坏内皮细胞间的粘附连接IF 17.694 Nat.Commun│脂蛋白相关磷脂酶A2抑制剂Darapladib通过重塑脂质代谢使癌细胞对铁死亡敏感
★ 前言 ★ 2023年9月15日，韩国生命科学技术研究院代谢调节研究中心的Eun-WooLee团队在nature communications上发表了题为“The lipoprotein-associated phospholipase A2 inhibitor Darapladib sensitises cancer cells to ferroptosis by remodelling lipid metabolism”的文章。该研究揭示了脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)控制细胞内磷脂代谢并有助于铁死亡抵抗。 01 背景介绍 铁死亡（Ferroptosis）是一种新发现的程序性坏死形式，需要游离的活性铁。活性氧(reactive oxygen species，ROS)在膜磷脂(membrane phospholipids，PLs)中的过量积累是导致铁死亡的主要原因；因此，脂质ROS是ferroptosis的一个显著特征。脂质ROS主要由谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)控制，该酶直接将膜磷脂中的脂质过氧化物还原为脂醇。GSH同时被GPX4氧化，是GPX46的重要辅因子。细胞内的GSH水平主要由胱氨酸-谷氨酸反向转运体控制，由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸组成。基于此，一些靶向GPX4或胱氨酸-谷氨酸反向转运体的铁死亡诱导剂(FINs)被开发出来，并被视为癌症治疗的潜在药物。虽然GPX4/GSH系统保护大多数类型的细胞免受铁死亡的影响，但最近的研究表明，具有间充质特征的化疗耐药癌细胞或耐药癌细胞对铁死亡特别敏感。因此，铁死亡作为一种新兴的抗癌治疗策略得到了广泛的认可。此外，铁死亡还与多种人类疾病有关，如肾脏、心脏、脑和肝脏的缺血-再灌注损伤；因此，铁死亡抑制剂已被开发用于治疗这些疾病。磷脂酶A2s(PLA2s)是在磷脂sn-2位水解脂肪酸的酶，PLA2 superfamily中有50多种酶。PLAs主要分为分泌型PLA2(sPLA2)、胞浆型PLA2(cPLA2)、不依赖Ca2+的PLA2(iPLA2)和脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2;由PLA2G7编码,被称为血浆血小板活化因子乙酰水解酶[PAF-AH])，它们的序列和结构各不相同。PLA2的主要作用是从膜磷脂中提取AA，从而有助于前列腺素、白三烯和溶血磷脂等病理生理脂质介质的形成。由于AAs在铁死亡中起关键作用，PLA2被认为参与铁死亡。虽然已知cPLA2通过释放AA增加脂质过氧化物，但其对铁死亡的贡献尚不清楚，最近发现PLA2G6编码的iPLA2β可特异性切割含有AA(15-羟丙基乙二胺-聚乙烯)的氧化PE，从而抑制铁死亡。 02 图文解析
要点1： a.为了鉴定调节铁死亡的代谢途径，并发现与铁死亡诱导剂协同杀伤癌细胞的代谢药物，根据其调节RSL3诱导的铁死亡的能力，从文库中筛选出403个代谢调节化合物。 b-d.Darapladib对间质型胃癌细胞Hs746T和SNU-484细胞铁死亡具有增敏作用。值得注意的是，当与darapladib共处理细胞时，两种细胞系中RSL3的半数抑制浓度(IC50)值显著降低。RSL3联合darapladib处理后观察到的细胞活力的显著下降几乎完全被铁死亡抑制剂的Fer-1处理所消除。 e.通过PI摄取和LDH水平测定，证实了细胞活力的下降是由坏死细胞死亡引起的。 f.此外，RSL3在低密度铺板时诱导细胞死亡的效率更高，如之前报道的。在此条件下，darapladib进一步促进细胞死亡。 g.此外，0.5 μM的darapladib浓度足以增强GPX4抑制剂诱导的铁死亡。这些数据表明，darapladib特异性促进GPX4抑制剂诱导的铁死亡。
a.当用其他GPX4抑制剂，如ML210和ML210的衍生物JKE1674诱导铁死亡时，darapladib也增强了Hs746T和SNU-484细胞中的铁死亡。 b.值得注意的是，联合处理引起的细胞死亡的增加被Fer-1完全逆转，证实铁死亡确实被darapladib增强。 c.随后研究了darapladib是否也能响应其他铁死亡刺激，如GSH耗竭。在半胱氨酸缺乏的培养基中培养18 h不会大大降低细胞活力，但在含有darapladib的半胱氨酸缺乏的培养基中培养会导致Hs746T和SNU-484细胞的快速死亡。再次，细胞活力被Fer-1显著恢复，表明darapladib也使敏化作用细胞对半胱氨酸剥夺诱导的铁死亡。 d-e.使用C11 BODIPY581/591检测铁死亡的标志脂质过氧化水平。用0.1 µ MRSL3处理细胞，与对照组相比，脂质过氧化水平没有增加。然而，通过流式细胞术和荧光显微镜证明，超过80%的darapladib和RSL3共处理的细胞显示氧化的C11-BODIPY。 f.这些信号被Fer-1完全消除，证实脂质过氧化作用确实增强。此外，尽管在半胱氨酸剥夺后~14 h细胞死亡前一过性地出现了氧化的C11BODIPY信号，但在~12 h观察到氧化的C11BODIPY信号，表明darapladib促进了脂质过氧化。这些数据表明，darapladib通过增加脂质过氧化使细胞对铁死亡敏感。
a-b.当细胞在脂蛋白缺乏的人血清(lipoprotein-deficient human serum，LPDS)中培养时，RSL3诱导的铁死亡显著减弱，并且当给药6 h时，darapladib没有进一步的作用。 c.值得注意的是，RSL3处理诱导了在含有darapladib的LDPS中培养24 h的细胞死亡，但没有杀死对照组细胞。这些数据表明，尽管脂蛋白缺乏通常会减缓铁死亡的反应，但在缺乏脂蛋白的情况下，darapladib仍然能够增加铁死亡。 d.此外，darapladib在血清饥饿条件下使细胞对铁死亡敏感，支持脂蛋白在darapladib介导的铁死亡敏感性中不可或缺的作用。 e.如先前报道的那样，由于与RSL3共价结合，GPX4条带发生偏移，但GPX4的水平不变。此外，还观察到RSL3和/或darapladib处理后的蛋白表达没有显著差异。 f.由于游离铁的可用性也是铁死亡执行的关键因素，研究人员还研究了darapladib治疗后的游离铁水平。然而，darapladib并不调节细胞内铁水平。
a.研究人员利用CRISPR-Cas9系统建立了PLA2G7缺失的H1299和YCC-16细胞，并在mRNA水平上证实了的完全敲除。 b-f.同样，PLA2G7 KO细胞对RSL3的敏感性高于亲本细胞，对铁死亡的敏感性增加被Fer-1逆转。 g.PLA2G7 KO细胞的脂质过氧化水平增加。 h-j.此外，在半胱氨酸缺乏的条件下，野生型细胞活力并没有大幅度降低，但PLA2G7 KO细胞发生了快速的细胞死亡，Fer-1减弱了这种现象。 k.PLA2G7 KO细胞对darapladib增强的铁死亡敏感性降低，支持Lp-PLA2对darapladib的需求。这些数据表明，在铁死亡中，细胞而非血清中产生的Lp-PLA2可能发挥了关键的保护作用。 l.研究人员探讨了在细胞中异位表达Lp-PLA2蛋白是否可以改善RSL3诱导的铁死亡。过表达Lp-PLA2的Hs746T细胞对RSL3诱导的细胞死亡的敏感性降低。 m.此外，过表达Lp-PLA2降低了RSL3诱导的脂质过氧化。综上，这些发现表明Lp-PLA2是铁死亡的真正负调控因子。
要点5： a.研究人员观察到细胞沉淀物中的异位Lp-PLA2与培养基中的相当。 b.过表达的Lp-PLA2存在于细胞质和质膜中。 c.为排除细胞外Lp-PLA2的参与，将细胞的培养基更换为无血清培养基，以去除培养基中存在的Lp-PLA2，并立即用RSL3刺激细胞。发现darapladib在RSL3处理后30 min仍然能够增加脂质过氧化水平。 d-e.同样，在没有血清的新鲜培养基存在的情况下，PLA2G7 KO细胞比对照细胞对铁死亡更敏感。这些数据表明，细胞内Lp-PLA2可能对铁死亡具有保护作用。 f-g.通过LC-MS评估PLA2G7缺失下的脂质组学变化，发现PLA2G7 KO细胞中PEs水平普遍升高，而细胞中溶血磷脂酰乙醇胺(lysoPE)和溶血磷脂酰胆碱(lysoPC)水平降低。与含有较少双键的PE物种相比，含有三个或三个以上双键的PE物种的水平显著增加。
要点6： a.脂质谱分析显示，darapladib处理的细胞中PEs水平普遍升高，而darapladib降低了游离脂肪酸(FFA)和溶血磷脂酰乙醇胺(lysoPE)水平。 b.darapladib处理后，oxPE-18：0-20：4与PE-18：0-20：4的比例也略有增加，这表明Lp-PLA2对氧化的SAPE的活性也部分贡献于铁死亡敏感性。 c.darapladib强烈抑制AA-d11的产生，而iPLA2的抑制剂(S)-BEL显示出有限的能力，表明Lp-PLA2活性是PE切割所必需的。 d.AA增加了细胞对铁死亡的易感性，但darapladib仅在AA存在的情况下轻微加剧了铁死亡。 e.相反，补充OA，其水平在darapladib处理后降低，在RSL3和darapladib存在的情况下抑制铁死亡。
a-b.研究人员首先证实了与其他GPX4抑制剂类似，PACMA31以剂量依赖的方式诱导了GPX4的条带位移，并增加了GPX4在细胞裂解液中的热稳定性，表明PACMA31直接与GPX4结合。 c.PACMA31在细胞中表现出与其他GPX4抑制剂相当的IC50值，且该作用可被ferrostatin-1完全抑制，支持PACMA31是可靠的铁死亡诱导剂的观点。 d-f.PACMA31与darapladib协同杀伤细胞。 g-h.研究人员使用SNU-484细胞建立了小鼠异种移植模型，并测试了PACMA31和darapladib的联合治疗。将SNU-484细胞皮下注射到裸鼠中，然后对裸鼠进行PACMA31和/或darapladib治疗。与使用载体对照组治疗小鼠相比，单独使用PACMA31或darapladib治疗小鼠没有统计学上的显著差异。然而，与对照组相比，同时接受PACMA31和darapladib治疗的小鼠的肿瘤生长明显减少。最终，与对照组相比，联合治疗组肿瘤的大小和重量显著减少。此外，ferrostatin-1在darapladib和PACMA31治疗后挽救了减少的肿瘤生长和重量，表明铁死亡有助于肿瘤抑制。 全文小结 综上所述，Lp-PLA2通过降低含PUFA的磷脂酰乙醇胺水平和裂解氧化磷脂酰乙醇胺，从而抑制铁死亡。因此，使用darapladib抑制Lp-PLA2可能有利于铁死亡诱导的癌症治疗策略。此发现为癌症中同时靶向Lp-PLA2和铁死亡的可能组合策略提供了新的见解。 参考文献：Oh, M., Jang, S.Y., Lee, JY. et al. The lipoprotein-associated phospholipase A2 inhibitor Darapladib sensitises cancer cells to ferroptosis by remodelling lipid metabolism. Nat Commun 14, 5728 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-41462-9 |
