IF15.1 Advanced Science│腺管凹细胞中ATOH1的缺失通过GAS1激活Akt/mTOR信号通路驱动胃腺癌的干性和进展

IF15.1 Advanced Science│腺管凹细胞中ATOH1的缺失通过GAS1激活Akt/mTOR信号通路驱动胃腺癌的干性和进展

前言

2023年10月12日，福建医科大学黄昌明、陈启跃及郑朝辉共同通讯在Advanced Science在线发表题为“Loss of ATOH1 in Pit Cell Drives Stemness and Progression of Gastric Adenocarcinoma by Activating AKT/mTOR Signaling through GAS1”的研究论文，该研究旨在阐明ATOH1在维持GCSC功能中的作用。临床前模型和GAC样本分析结果表明，ATOH1缺乏与GAC预后不良和化学耐药性相关。

背景介绍

胃腺癌(GAC)是全球第五大常见癌症，也是导致癌症相关死亡的第三大原因化疗和肿瘤复发是与GAC治疗相关的持续和未解决的问题胃癌干细胞(GCSCs)是从胃癌细胞中分离出来的一小群自我更新的肿瘤细胞由于GCSCs具有固有的干细胞样特性，它们在肿瘤进展和治疗耐药性中起着至关重要的作用。CSCs采用静止状态的能力已成为耐药性的重要驱动因素。不幸的是，传统的以5-FU为基础的化疗对GCSCs的低疗效经常导致治疗失败阐明GCSCs的调控机制可能有助于开发新的靶向策略来消除这些细胞并改善GAC的预后。

图文解析

图

图1

要点1：

A.在FJMUUH、FHUSTC和QHPH组中分别发现了476 727和319个logFC<-2的下调基因，调整后P<0.05。维恩图显示了所有三个队列共有的70个下调基因。在来自FJMUUH的化疗耐药和化疗敏感GAC病例中检测到23个下调基因。这两组仅在ATOH1中重叠。

B.对来自本研究和先前发表的研究的GAC和癌旁样本进行了单细胞转录组测序(scRNA-seq)差异基因表达分析发现了几种与培养胃上皮相关的标记，它们在胃上皮细胞中的表达通过T分布随机邻居嵌入(tSNE)显示，如PGAC、MUC5AC和TFF1。

C.此外，ATOH1在GAC样本的TFF1+上皮细胞中几乎不表达，而在癌旁样本中则不表达。

D.内源性TFF1表达于胃体和胃窦的胃窝区，并与胃窝细胞中的Atoh1共定位。生成了Tff1-CreERT2;Rosa26Tdtomato小鼠，并证实Tff1+谱系小鼠的胃中含有Atoh1+细胞，而小肠和结肠中未检测到Tff1+谱系。E.他莫昔芬可抑制Tff1-CreERT2胃上皮Tff1+细胞中Atoh1蛋白的表达;Atoh1fl/fl;Rosa26Tdtomato小鼠。

F-G.谱系追踪显示，Tff1+细胞在缺乏Atoh1的情况下增殖。H-J.持续Apc和p53消融导致Tff1-CreERT2在他莫昔芬诱导后90天发生胃肿瘤;Apcfl/fl;p53fl/fl(TcPP)小鼠。I-K.假设Tff1-CreERT2转基因介导的Atoh1消融会增强这种作用。因此，对TcPP和Tff1-CreERT2给予他莫昔芬;Apcfl/fl;p53fl/fl;Atoh1fl/fl(通过携带“floxed”ATOH1等位基因的小鼠。观察到在他莫昔芬诱导90天后， Atoh1fl/fl队列小鼠的肿瘤负荷和数量显著增加。

图2

要点2：

A.Western blot和qRT-PCR分析显示ATOH1在各种GAC细胞系中表达。与正常胃上皮GES细胞相比，GAC细胞组中的ATOH1 mRNA和蛋白质水平显着降低。B-E.ATOH1过表达抑制初级和次级球体的形成。Western blot和免疫荧光显示ATOH1过表达下调GCSC标记物CD44和球体中的自我更新标记SOX2。相反，ATOH1敲低显着增加了初级和次级球体的数量和大小。F.连续肿瘤异种移植稀释显着降低了肿瘤起始能力，从603611个AGS细胞（对照）中的1个降低到3488397个细胞中的1个（ATOH1过表达）（P=0.008）。此外，与对照细胞相比，ATOH1过表达的NCI-N87细胞表现出较低的致瘤性和较慢的肿瘤生长。G-H.ATOH1过度表达减小了类器官的大小并破坏了类器官的结构。同样，ATOH1过度表达显着(P<0.001)损害人类类器官。I.观察到TcPP肿瘤中CD44+和SOX2+上皮细胞的数量显着增加；Atoh1fl/fl小鼠队列与TcPP的比较；ATOH1fl/+队列在他莫昔芬诱导后90天（CD44+：60.5±7.0%vs43.0±5.3%，P=0.002；SOX2+：82.7±5.1%与68.6±6.8%，P=0.006）。

图3

要点3：

A.通过使用ATOH1的RNA-Seq和ChIP-Seq数据进行综合分析，研究人员鉴定了25个上调基因，包括与ATOH1结合的GAS1。

B-F.荧光素酶报告基因检测显示ATOH1激活了GAS1启动子。序列分析揭示了GAS1启动子中三个假定的ATOH1结合位点。序列删除和定点突变表明第一个ATOH1结合位点对于ATOH1诱导的GAS1反式激活至关重要。ChIP测定证实ATOH1与GAC细胞中的GAS1启动子直接结合。这些结果表明GAS1是直接转录的ATOH1目标。组织微阵列（TMA）的IHC染色显示ATOH1与人GAC中的GAS1表达呈正相关（P<0.001）。ATOH1过表达上调人类类器官中的GAS1。这些结果表明ATOH1通过激活GAS1启动子来调节GCSC。

图4

要点4：

A.为了阐明ATOH1调节GAC的下游分子机制，在TCGA、FJMUUH和GEO数据集上进行了GSEA。将具有高ATOH1表达的ATOH1队列与具有低ATOH1表达的ATOH1队列进行比较，所有数据集中AKT/mTOR信号传导均丰富。

B.考虑到GAS1可能是与受体酪氨酸激酶RET复合的共受体蛋白,研究了ATOH1是否通过GAS1/RET/影响恶性肿瘤。AKT/mTOR信号传导。对异位表达FLAG标记的GAS1的AGS和NCI-N87GAC细胞系进行了免疫共沉淀(Co-IP)，并验证了蛋白质-蛋白质相互作用。使用抗FLAG的GAS1下拉测定将RET识别为GAS1结合伴侣。

C.两种细胞系中与抗RET的相互Co-IP显示GAS1是一种相互作用蛋白。因此，GAS1可能与RET结合形成新的蛋白质复合物，抑制RET/AKT/mTOR发信号。

D-E.ATOH1过表达显着降低球体中的RET、AKT和mTOR磷酸化水平，并下调类器官中的RET/AKT/mTOR磷酸化水平。

F.为了研究ATOH1是否通过AKT/mTOR信号通路调节GAC干性，添加了AKT/mTOR通路抑制剂盐酸硫利达嗪(THO)来治疗发育中的球体，同时敲低ATOH1。THO给药显着抑制了ATOH1敲低引起的球体形成的增加。

G-I.观察到TcPP窦部的p-RET+、p-AKT+和p-mTOR+上皮细胞显着增加；Atoh1fl/fl小鼠与TcPP小鼠的比较；他莫昔芬诱导后90天的Atoh1fl/+小鼠（p-RET+：13.6±3.4%vs33.8±4.0%，P<0.001；p-AKT+：70.1±6.5%vs88.7±4.1%，P<0.001；p-mTOR+：76.4±6.2%与92.3±3.5%，P=0.001）。这些结果表明RET/AKT/mTOR信号传导在GAC恶性肿瘤中介导ATOH1调节。

图5

要点5：

A.为了阐明ATOH1缺失调节DNA甲基化的机制，研究ATOH1的下调是否与其GAC中启动子的甲基化状态有关。进行亚硫酸氢盐测序来评估六对GAC和邻近正常组织中的ATOH1启动子甲基化水平。ATOH1启动子的CpG岛和选定的亚硫酸氢盐测序区域。

B.ATOH1启动子中-1,362和-1,341bp处的CpG位点在GAC组织中的甲基化水平显着高于其邻近的非癌组织。

C-E.GAC细胞系中的ATOH1甲基化水平显着高于正常胃上皮细胞中的ATOH1甲基化水平。用去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-AzaC)处理GAC细胞，以确定ATOH1是否因其启动子的高甲基化而下调。5-AzaC处理显着增加GAC细胞中ATOH1mRNA和蛋白水平。为了确定各种DNA甲基转移酶(DNMT)在介导GAC中ATOH1启动子甲基化中的潜在作用，使用特定的小干扰RNA(siRNA) 敲低GAC细胞中的DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。

F-J.敲低DNMT1但不能敲低DNMT3A或DNMT3B可以挽救ATOH1表达。DNMT1过表达显着抑制ATOH1表达。为了确定DNA甲基化对ATOH1启动子活性的影响并确认-1,362和-1,341bpCpG位点参与启动子调控，将野生型ATOH1启动子构建体或含有位点特异性CpG突变的启动子构建体转染到SNU-5中和Kato-III细胞。DNMT1过表达显着降低了野生型启动子的活性。然而，-1,362和-1,341bpCpG位点的CG-to-TG突变逆转了DNMT1对ATOH1启动子活性的抑制作用。因此，启动子区-1,362和-1,341bpCpG位点的甲基化状态对于ATOH1的表观遗传调控至关重要表达。这些发现表明ATOH1下调与其启动子在GAC中的高甲基化有关。

L-K.研究药理学DNMT抑制是否通过调节ATOH1/GAS1/RET/AKT/mTOR信号传导来抑制肿瘤发生。5-AzaC治疗抑制AGS肿瘤异种移植物生长。它还上调ATOH1和GAS1，并显着下调球体中的p-RET、p-AKT和p-mTOR。接下来，探讨ATOH1上调是否抑制5-AzaC介导的RET/AKT/mTOR发信号。对ATOH1敲低的Kato-III球体进行5-AzaC处理，sh ATOH1对RET/AKT/mTOR信号通路的影响减弱。5-AzaC处理削弱了ATOH1敲低的SNU-5和Kato-III细胞中的球状体形成。它还显着抑制SNU-5肿瘤异种移植物的生长。这些结果表明，抑制DNMT1活性通过调节ATOH1/GAS1/GAC中的RET/AKT/mTOR信号传导。

图6

要点6：

A-C.Kaplan-Meier生存分析显示， ATOH1高患者的五年总生存率(OS)优于ATOH1低患者（62.3%vs44.3%；P<0.001）。ATOH1高患者的五年无病生存率(DFS)显着高于ATOH1低患者（58.8%vs42.4%；P=0.002）。ATOH1高患者的总体复发率低于ATOH1低患者（P<0.001）。单变量和多变量Cox分析表明ATOH1高状态是生存的独立保护因素。

D-E.进行Kaplan-Meier分析，以确定ATOH1水平是否与接受辅助化疗(ACT)的GAC患者的预后相关。无论是否给予ACT，ATOH1低患者的OS和DFS均较低。ATOH1高患者在ACT后的生存率高于ATOH1低患者。这些发现表明ATOH1上调与GAC患者的化疗敏感性和预后相关。评估了ATOH1表达与TNM分期相结合对预后准确性的影响。ATOH1基于时间依赖性受试者工作特征(ROC)、C指数和Akaike信息标准(AIC)分析，为临床病理特征增加了预后价值。

图7

要点7：

A-C.他莫昔芬诱导后68天，TcPP；Atoh1fl/+和TcPP；Atoh1fl/fl小鼠每周接受一剂5-FU治疗。在最终5-FU剂量后24小时收获未治疗和治疗小鼠的组织样本。在TcPP中；Atoh1fl/+小鼠中，5-FU处理的肿瘤体积显着低于未处理的对照。然而，这种差异在TcPP中并不明显；Atoh1fl/fl小鼠。

D-E.他莫昔芬诱导后68天，TcPP；Atoh1液量/液量小鼠每周接受1剂5-FU治疗，每周两次1剂THO治疗，或同时接受5-FU和THO治疗4周。5-FU+THO处理的肿瘤体积最小。F-H.单独用THO治疗的小鼠中增殖细胞很少，而5-FU+THO治疗的小鼠中增殖细胞甚至更少。不同治疗方案对于改善TcPP疾病进展的功效不同；Atoh1fl/fl小鼠模型强调了将AKT/mTOR抑制剂与标准化疗相结合以预防GAC进展的治疗价值。

I.探讨ATOH1表达改变对人类GAC类器官化疗敏感性的影响。ATOH1过表达挽救了类器官的化学敏感性，并比单独用5-FU治疗更大程度地抑制了它们的生长。这些结果表明，病毒介导的ATOH1过表达可抑制体内肿瘤生长并增加GAC细胞对5-FU的敏感性。

本文小结

综上所述，研究人员确定DNMT1介导的高甲基化通过阻断GAS1启动子转录导致ATOH1缺陷。这进而激活RET/AKT/mTOR信号通路，在GAC细胞中获得CSC样和耐药特性，导致GAC预后不良。

参考文献：

Zhong Q, Wang H G, Yang J H, et al. Loss of ATOH1 in Pit Cell Drives Stemness and Progression of Gastric Adenocarcinoma by Activating AKT/mTOR Signaling through GAS1[J]. Advanced Science, 2023: 2301977.

https://doi.org/10.1002/advs.202301977