IF 19.328，Molecular Cell│LKB1通过CRTC2依赖性组蛋白乙酰化控制炎症潜力IF 19.328，Molecular Cell│LKB1通过CRTC2依赖性组蛋白乙酰化控制炎症潜力
肿瘤中的异常炎症反应是肿瘤发展的重要特征之一，而LKB1是一个重要的抑癌基因，其突变与多种肿瘤的发生和发展密切相关。肝激酶B1（LKB1）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在代谢、细胞极性、细胞生长和增殖中具有重要的调控作用。LKB1功能丧失（通过丝氨酸/苏氨酸激酶11 [STK11] 基因的突变）在人类癌症中很常见，而STK11杂合性遗传突变会使人类和小鼠易患息肉综合征（PJS），这是一种常染色体显性遗传疾病，其特征是胃肠道中出现错构瘤息肉。除了胃肠道问题外，PJS患者在65岁前患上胃肠道、乳腺、胰腺和妇科癌症的累积风险为93%，这与BRCA1/2携带者的癌症风险相似。LKB1功能丧失是人类上皮癌症中最常见的遗传突变之一，包括非小细胞肺癌（NSCLC），其中常与KRAS共突变，胰腺癌和宫颈癌。LKB1突变与患者预后不良以及对常规化疗和免疫检查点抑制剂（ICIs）的耐药性有关。尽管有这些观察结果，但LKB1突变如何导致PJS息肉和恶性肿瘤的发展仍不清楚，这限制了治疗选择并增加了患者的死亡率。 图文解析 要点1： A-B.LKB1缺陷MEF与其对照对应物之间差异表达基因的基因集富集分析（GSEA）（通过RNA测序[RNA-seq]测量）揭示先前与LKB1丢失相关的几种途径（即DNA修复，上皮-间充质转化[EMT]，KRAS信号传导）的富集以及与炎症过程相关的基因富集，包括IL-6-JAK-STAT信号传导和细胞因子-细胞因子受体相互作用编码IL-6（即Il6，II11，Clcf1和Lif），趋化因子（即Cxcl12，Cxcl2，Cxcl5）和肿瘤坏死因子（TNF）（即Tnfsf11 / RANKL）超家族的基因在基线时LKB1-null MEF中显着增加。同样，PJS 息肉也显示 Il6 和 Il11 的表达升高，这与慢性胃部炎症和胃肠道肿瘤的发展有关，以及Cxcl2，一种参与中性粒细胞募集的促炎趋化因子。这些数据证实了LKB1缺陷NSCLC细胞中炎症细胞因子表达增加的观察结果，也验证了模型。 C-D. 确定LKB1缺陷细胞对炎症刺激的反应，刺激了Lkb1−/−具有多种炎症激动剂和培养上清液中分泌IL-6水平的MEF。Lkb1−/−与对照细胞相比，MEF在基线时产生的IL-6水平增加;此外，Lkb1−/−细胞对所有测试的激动剂类别显示出增强的IL-6反应，包括脂多糖（LPS），IL-1（IL-1α和IL-β），TNF-α以及I型和II型干扰素。尽管对照MEF对IL-1α和IL-1β刺激基本上是难治的，但Lkb1−/−MEF对IL-1β反应迅速，以剂量依赖性方式产生越来越多的IL-6。 E.使用多重细胞因子/趋化因子阵列，鉴定白血病抑制因子（LIF）和IL-11是LKB1产生的其他分泌因子，但不是野生型，响应IL-1β的MEF。在相对于对照的LKB1缺陷细胞中，还观察到IL-1β刺激的CXCL2（在LKB1突变型PJS息肉中表达）和血管内皮生长因子（VEGF）的产生增加，先前已被证明在LKB1中升高成纤维细胞。 F.使用RNA-seq来确定LKB1丢失是否影响炎症相关基因响应IL-1β刺激的转录。IL-1β刺激基因在LKB1间的差异表达和GSEA分析对照MEFs显示LKB1-null细胞中细胞因子-细胞因子受体基因的富集。IL-6家族细胞因子（Il6，Lif，II11），Tnfsf11 /RANKL和Vegfa的表达在基线时在LKB1缺陷细胞中升高，并在IL-1β刺激时进一步升高。
要点2： A.LKB1 通常在 KRAS 突变的肺腺癌中发生突变，先前的工作在LKB6缺陷的NSCLC细胞中发现了IL-3-STAT1信号传导升高。因此，用各种炎症激动剂刺激缺乏p12（KP）或p53和Stk53 / LKB11（KPL）的Kras突变体（G1D）NSCLC细胞，发现缺乏LKB1的KPL细胞在暴露于炎症激动剂（包括IL-6β）时显示出增加的IL-1产生。即使在基线时，KPL细胞的LIF分泌水平也比KP细胞高约10倍，暴露于炎症刺激进一步增强了LIF分泌。 B-C.检查LKB1突变组织通过诱导Lkb1感染性休克对体内炎症刺激的反应,小鼠通过LPS注射。Lkb6中循环IL-1水平显著升高全身暴露于LPS后的小鼠，与野生型小鼠相比。此外，观察到Lkb6脾脏中IL-1 mRNA的水平增加LPS暴露后小鼠相对于Lkb1小鼠。观察到Lkb6肝脏和肺部IL-1 mRNA水平增加的趋势小鼠与野生型小鼠相比;然而，这并没有达到统计学意义。总的来说，这些数据表明LKB1缺失导致对不同组织类型的各种炎症刺激的高反应性，这表明LKB1调节细胞内在炎症潜力的共同机制。 A-B.为了确定LKB1丢失使细胞对炎症刺激敏感的机制，研究了下游信号传导。已知LKB1调节14种下游激酶的功能，包括AMPK和ARK家族的成员，其功能和/或组织表达不同。缺乏 AMPK 活性的 MEF显示与对照组相比，LPS和IL-1β刺激的IL-6产生增加，但明显低于在LKB1缺陷MEF中观察到的水平。 C.LKB1的缺失导致mTORC1的信号传导增加。然而，IL-1β刺激并没有促进mTORC1途径的激活增加（通过S6激酶[S6K]，核糖体-S6蛋白或4E-BP的磷酸化测量），超过血清刺激诱导的激活，表明mTORC1信号传导没有被IL-1β刺激显着改变。此外，用雷帕霉素抑制mTORC1活性不影响Lkb1刺激的IL-6β刺激的IL-1产生−/−MEF。总之，这些数据表明，AMPK-mTORC1信号传导以外的途径调节LKB1丢失下游的炎症信号传导。 D.为了鉴定IL-1产生的LKB6依赖性介质，我们对MEF中的AMPK和ARK进行了siRNA介导的筛选。SOCS3是JAK-STAT信号传导的负调节因子，可负调节体内IL-6信号传导。MYD88是一种通用衔接蛋白，可转导来自Toll样受体（TLR）和IL-1受体的炎症信号。沉默Socs3增加，而沉默Myd88减少，在野生型MEF中LPS刺激时IL-6分泌，验证了该测定法用于识别响应炎症刺激的IL-6分泌的潜在调节因子。沉默Prkaa1（Ampkα1）和/或Prkaa2（Ampkα2）不会导致基线或LPS刺激的IL-6产生增加，这表明MEF中AMPK的急性沉默不会表象化当LKB1在MEF中沉默时炎症反应增强。然而，沉默SIK（Sik1-3）家族的成员导致LPS刺激的IL-6产生增加，类似于LKB1沉默时观察到的情况。 E.为了进一步探索SIK信号在IL-6生产中的作用，使用了泛SIK抑制剂HG-9-91-01，它具有IC50SIK0、SIK92 和 SIK6 分别为 6.9、6.1 和 2.3 nM。用HG-9-91-01处理野生型MEF以剂量依赖性方式促进IL-1β刺激的IL-6产生增加，指出LKB1-SIK信号传导是IL-1β介导的炎症反应的细胞内在调节回路。 F-G.LKB1 组成型磷酸化并激活 SIK，导致 CREB 调节的转录共激活剂（CRTC）和IIa类组蛋白脱乙酰酶（HDAC）的下游磷酸化，防止它们易位到细胞核。为了确定LKB1依赖性炎症反应是否通过这些节点中的任何一个发出信号，在LKB1缺陷的MEF中进行了针对HDAC和CRTC的siRNA筛选。免疫印迹证实，在Lkb4中只有HDAC9和HDAC1是核的MEF。Crtc2的敲低，单独或与Crtc1组合，逆转了Lkb1 −/−IL-6 产生增加的表型，将 CRTC2 鉴定为 LKB1-SIK 信号传导下游促进炎性细胞因子表达的主要靶标。 H. Hdac4和Hdac9的敲低增强了LKB6-null MEF中IL-1的产生，这表明在LKB6缺乏的情况下，它们可能是IL-1产生的负调节因子，而不是正调节因子。接下来，利用CRISPR-Cas9编辑生成LKB1/ CRTC2双敲除MEF . Lkb2 中的 CRTC1 缺失MEF在基线时阻断了IL-6的产生，并响应LPS和IL-1β处理。总体而言，这些数据将LKB1-SIK-CRTC2信号传导确立为一种抗炎通路，其调节IL-6的产生以响应各种炎症刺激。
要点4： A-B.CRTC2在LKB1缺乏的情况下调节炎症反应的机制。当在细胞核中时，CRTC2充当碱性区域/亮氨酸拉链基序（bZIP）转录因子（bZIP）的共激活剂，包括CREB。SIK通过在Ser2磷酸化CRTC2来拮抗CRTC171-CREB信号传导，导致14-3-3蛋白结合并在细胞质中隔离CRTC2。LKB1的缺失使SIK失活，从而在多个组织中诱导CRTC-CREB依赖性转录反应。IL-1β刺激MEFs的免疫印迹分析显示，CRTC2在Lkb1的核级分中高度富集MEF与野生型细胞的比较;然而，核CRTC2水平不受IL-1β刺激的影响。我们还观察到 LKB2 缺陷型 MEF中CRTC1的低磷酸化。检查Lkb1全细胞裂解物中CREB133 Ser1磷酸化与野生型细胞相比，细胞未显示磷酸化CREB1水平存在显着差异;然而，观察到CREB1 Ser133磷酸化水平升高，特别是在Lkb1−/−IL-1β处理后的MEF与野生型细胞的比较。 C.对照组和AMPK缺陷型MEF之间的CRTC2磷酸化水平相似，我们观察到CREB1 Ser133磷酸化水平降低，与先前将CREB1表征为AMPK靶标的发现一致。总之，这些数据与LKB2缺陷细胞中低磷酸化CRTC1的核定位增加的模型一致，这反过来又促进了CRTC-CREB依赖性转录反应。删除CRTC2有效地使LKB1缺陷的MEFs对炎症刺激难治，因为Lkb2中的CRTC1缺失MEFs在所有测试的IL-6β浓度下阻止IL-1的产生。 D-E.为了鉴定受CRTC1调控的LKB2依赖性炎症因子，我们对Lkb1进行了转录分析Lkb1−/− MEF和Lkb1的两个不同克隆 Lkb1−/−/Crtc2−/−IL-1β刺激后的MEF。细胞因子途径的基因，LKB1调节的炎症基因聚集成CRTC2依赖性和CRTC2依赖性组。CRTC2依赖性基因包括IL-6家族细胞因子（Il6，II11，Lif），Vegfa和Tnfsf11/RankL，而趋化因子基因（Cxcl2，Cxcl1，Cxcl5，Ccl2）的表达与CRTC2无关。使用定量PCR（qPCR），验证Il6和II11在基线和响应IL-1β中的 Lkb1−/−/Crtc2−/−细胞与Lkb1−/−细胞。 F-G.研究CRTC2是否介导了LKB1缺陷NSCLC细胞对炎症刺激的高反应性。首先，使用免疫印迹来检查IL-2β刺激后KP和KPL NSCLC细胞中CRTC1和CREB信号传导的动力学。类似于 Lkb1−/−与KP细胞相比，MEF，CRTC2被次磷酸化并且高度富集在KPL细胞的核部分中。响应IL-1β，与KP细胞相比，观察到KPL细胞的全细胞和细胞核部分中CREB1 Ser133磷酸化水平升高。接下来，生成了同样缺乏CRTC2（KPL / Crtc2−/−），通过CRISPR-Cas9基因编辑。与MEF中CRTC2缺失的结果类似，KPL细胞中CRTC2的缺失在基线时阻断了IL-6和LIF的产生，并响应了几种炎症激动剂。这些发现将CRTC2确立为调节LKB1下游多种细胞类型炎症反应的常见机制。 H-I.转录因子CREB1已知与CRTC2相互作用。为了阐明CREB1是否与CRTC2协同工作，调控LKB1丧失后的炎症基因表达，生成LKB1/CREB1双重敲除的MEFs（Lkb1-/-/Creb1-/-）。与CRTC2删除类似，CREB1删除降低了基线IL-6产生，并阻止了LPS-和IL-1β刺激的IL-6产生在Lkb1-/- MEFs。相比于Lkb1-/-细胞，Lkb1-/-/Creb1-/-细胞的LIF产生也在基线和对IL-1β的反应中减少。除了CREB1，CRTC2也被显示在脂肪细胞分化过程中与STAT3协同工作以促进基因表达。55在Lkb1-/- MEFs中删除STAT3，与具有完整STAT3信号的Lkb1-/-细胞相比，IL-6和LIF的产生都减少。总的来说，这些数据显示CRTC2与CREB1和STAT3协同工作，调控炎症因子的产生——特别是在LKB1丧失的背景下的IL-6家族细胞因子。
A.CRTC2是一个包括CREB和组蛋白乙酰转移酶（HATs）CREB结合蛋白（CBP）和p300（CBP/p300）的多亚基转录复合物的一部分。CBP/p300依赖的组蛋白H3在赖氨酸27位（H3K27ac）的乙酰化与转录激活相关，而CREB在Ser133位的磷酸化促进了与CBP/p300的关联增加。鉴于我们观察到HDAC4/9抑制增加了LKB1-null MEFs中的IL-6产生，我们假设CRTC2可能与CREB和CBP/p300在LKB1缺陷细胞中协同工作，改变乙酰化组蛋白的许可，并促进炎症基因表达。在体外HAT活性试验中，我们观察到与对照相比，Lkb1-/- MEFs中IL-1β刺激的HAT活性增加了约40%。 B.使用染色质免疫沉淀结合下一代测序（ChIP-seq），我们观察到在基线或IL-1β刺激后，野生型和Lkb1-/- MEFs在转录起始位点（TSSs）的H3K27ac全局富集没有差异。相比之下，我们观察到在IL-1β刺激的Lkb1-/-细胞与野生型相比，前500个差异表达基因和最上游的细胞因子基因的TSS附近的H3K27ac水平显著增加。 C-E. 接下来，检查LKB1缺陷细胞中表达增加的炎症基因上的H3K27ac分布。在Il6基因上，IL-1β处理在野生型细胞中促进了TSS周围H3K27ac水平的适度增加。LKB1缺陷的MEFs在基线上显示出较高的H3K27ac水平，而IL-1β处理进一步增加了乙酰化水平。这一趋势通过ChIP-qPCR得到验证，其显示在基线上，Lkb1-/- MEFs在Il6 TSS的H3K27ac水平比野生型增加约5倍，而在IL-1β刺激后又增加了3倍。重要的是，在Lkb1-/-细胞中消除CRTC2表达降低了Il6启动子上增加的H3K27ac。对于Il11基因，其mRNA表达在LKB1缺陷但不是野生型MEFs中被IL-1β刺激。 F.在基线上观察到在Lkb1-/-细胞中启动子区域的H3K27ac水平增加，而这些水平在IL-1β处理后进一步增加，并在CRTC2删除后消失。相比之下，无论炎症刺激如何，野生型细胞在Il11基因位点显示出很少的H3K27ac富集。 G-H.检查了在Tnfsf11位点的H3K27ac富集，因为这个基因编码RANKL在Lkb1-/-细胞中无论炎症刺激如何都增加。我们观察到在基线和IL-1β刺激条件下，Lkb1-/- MEFs在Tnfsf11基因的TSS和整个基因体上的H3K27ac水平增加。同样，这些在Tnfsf11位点的染色质特性在野生型细胞中不存在，在缺乏CRTC2的Lkb1-/-细胞中反转。作为对照，我们检查了Gapdh和Actb基因位点的H3K27ac水平，这些基因的表达在对照，Lkb1-/-和Lkb1-/-/Crtc2-/- MEFs之间相似，并发现这些位点的H3K27ac富集水平无论基因型或IL-1β处理如何都相似。因此，失去LKB1促进了增加的CRTC2依赖的H3K27ac，改变了炎症基因上乙酰化依赖的表观遗传编程。
要点6： A-E.在Lkb1-/-细胞中，炎症基因位点上H3K27ac的增加可能归因于组蛋白乙酰化活性的增加或者组蛋白去乙酰化活性的减少。在LKB1的下游，SIKs除了向CRTC发送信号外，还向IIa类HDACs发送信号。为了测试CRTC2和CBP/p300依赖的组蛋白乙酰化是否驱动LKB1缺陷细胞的炎症潜能增加，使用CBP/p300抑制剂A485阻断CBP/p300 HAT活性的影响。对于纯化的CBP/p300酶，A485的IC50约为0.06μM，而在细胞系中的EC50则在2和6μM之间变化。使用1μM A485处理Lkb1-/- MEFs显著减少了IL-1β刺激的IL-6和LIF产生。同样，A485处理也减少了KPL NSCLC细胞中IL-1β刺激的IL-6产生。A485以剂量依赖的方式减少了Lkb1-/- MEFs中的IL-6产生，EC50约为400-500 nM，并且在浓度超过1μM时几乎完全抑制。与阻断CBP/p300不同，通过伏立诺他（又名亚苄酰阿霉素酸[SAHA]）抑制HDAC并未影响Lkb1-/- MEFs的IL-1β刺激的IL-6产生。 F.接下来，使用RNA-seq确定了抑制CBP/p300对Lkb1-/- MEFs在IL-1β刺激后的转录反应的影响。差异基因表达分析揭示了6115个基因的表达在A485处理后减少，而5122个基因的表达在IL-1β处理的Lkb1-/- MEFs中增加。GSEA分析显示，与野生型细胞相比，IL-1β刺激的Lkb1-/- MEFs中富集的KEGG细胞因子-细胞因子受体相互作用通路在A485处理的IL-1β刺激的Lkb1-/- MEFs中被特异性抑制。 G .值得注意的是，CRTC2依赖的IL-6家族基因（即Il6，Il11，Lif）在IL-1β刺激的Lkb1-/- MEFs中通常升高都被A485处理抑制。相比之下，CRTC2独立的趋化因子基因（即Cxcl1，Cxcl2）的表达受到A485处理的影响不大。 H-J.在机制上，检查了CBP/p300抑制对LKB1空缺细胞中组蛋白乙酰化动态的影响，并发现A485处理逆转了IL-1β刺激在LKB1敏感炎症基因位点上H3K27ac的增加，包括Il6，Lif和II11。H3K27ac水平的降低与IL-1β刺激的Lkb1-/- MEFs在A485处理后Il6，Lif和Il11 mRNA表达的丧失相关。总的来说，这些数据表明，组蛋白乙酰化是LKB1缺陷细胞中炎症细胞因子基因表达增加的机制驱动因素，这是一种可以通过抑制CBP/p300来靶向的表观遗传机制。 本文小结： 综上所述，研究揭示了LKB1在炎症潜力的表观遗传调控中的新作用。研究数据表明，由于LKB1和SIK下游的CRTC2信号失调，LKB1缺陷细胞对炎症刺激过度反应，导致炎症基因转录异常。最后，结果通过抑制 CRTC2-CBP/p300染色质修饰复合物，为LKB1相关疾病（包括PJS和耐药性LKB1突变肿瘤)提供了新的治疗潜力。 参考文献： Shelby E.,Susan M., Lisa M.et al. LKB1 controls inflammatory potential through CRTC2-dependent histone acetylation.molecular cell 5,11 (2023). https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.04.017 |
