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IF 16.6Nature Aging│CD133+内皮样干细胞在早衰和自然衰老小鼠中恢复新生血管并促进寿命

IF 16.6Nature Aging│CD133+内皮样干细胞在早衰和自然衰老小鼠中恢复新生血管并促进寿命



前言

2023年11月9日,深圳市系统性衰老与干预重点实验室,广东省基因组稳定与人类疾病预防重点实验室,深圳大学基础医学院国际肿瘤中心等机构联合在Nature Aging上发表了题为“CD133+ endothelial-like stem cells restore neovascularization and promote longevity in progeroid and naturally aged mice”的研究论文,研究发现在早衰和自然衰老小鼠中,补充野生型和年轻型内皮细胞分别可以恢复新生血管并延长寿命。



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背景介绍

组织变性是衰老的典型特征。存在于特定组织中的一小部分干细胞或祖细胞被称为组织干细胞(TSCs),它们能够自我更新并分化为组织特异性细胞,从而维持组织内稳态。越来越多的证据表明,TSCs功能和/或数量的下降是衰老和年龄相关疾病中再生能力下降的原因。特别是造血干细胞和间充质干细胞的功能和/或数量随着年龄的增长而下降。EPCs的数量和功能也与年龄相关,这可能是血管内皮(VE)修复能力降低的主要原因。然而,根本问题依然存在。目前尚不清楚TSC的下降、消耗或健康和年轻的TSC是否可以使衰老的组织/器官恢复活力并促进寿命。最近已有研究证明,VE功能障碍会导致小鼠的系统性衰老,这就提出了一个问题:如果有的话,EPC的下降是否会导致衰老加速。


图文解析

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图1

要点1:a.鉴于内皮细胞和造血细胞具有相同的起源,即成血管细胞,研究人员推断EPCs可能起源于基底膜。为了验证这一假设,研究人员采用了一种谱系追踪策略:将含有报告基因和增强的绿色荧光蛋白(EGFP)表达盒的ROSAmT/mG小鼠的骨髓单核细胞(BMNCs)移植到经致死剂量X射线(9Gy)照射的C57BL/6受体小鼠中。b.让受体小鼠恢复4周,然后进行单侧股动脉结扎(FAL)以刺激新生血管。3周后处死小鼠作进一步研究。骨髓再生度高达80%,外周血再生度接近50%。c-d.研究人员通过抗tdTomato和抗CDH5或抗CD31双染色的免疫荧光显微镜检查来检测供体源性BMNCs是否能分化为ECs。如图所示,大量tdTomato+细胞在骨髓移植(BMTed)小鼠心脏和肌肉组织中同时呈CDH5或CD31染色阳性。e.相邻主动脉组织切片的tdTomato live和anti-CD31染色荧光信号平行成像显示,CD31+ECs的很大一部分来自ROSAmT/mG。


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图2

要点2:a.对所有细胞的伪时间分析显示,被预测具有干细胞/祖细胞特性的BMNCs簇SC_1、SC_2和SC_3与ECs密切相关。进一步的伪时间分析表明,b-d.进一步的伪时间分析显示,SC_2具有更多的祖细胞特性,SC_2很可能代表位于ECs上游的EPCs。接下来,研究人员检查了三个簇和BM中其他种群的转录组,以确定簇SC_2的假定分子特征。有趣的是,一组细胞膜相关成分标记了SC_2簇,其中由PromI基因编码的CD133最为突出。研究人员将这一假定的标记集称为CD133+细胞特征,并将其表达与报道的EPC标记进行了比较:MACs的CD45、CD14和CD133+;CD105、CD14和CD31用于ECFCs;ECs的VCAM1、ICAM1和KDR和CD34,统称为CD34+EPC性状。随着假时间轴的变化,CD133t细胞性状在SC_2中主要表达,在SC_1中急剧下降,在ECs中几乎消失。CD34+EPC性状中,CD14在SC_2中表达量最高,其次是SC_1,在ECs中表达量最低。CD34和ICAM1在SC_1中有一定程度的表达,在SC_2中几乎不表达。研究人员推断CD133可能标记了推测的EPCs(称为CD133+ELCs)的早期阶段。e.因此,研究人员应用荧光活化细胞分选(FACS)富集3只C57BL/6N小鼠的CD133+BMNCs。为了实验验证CD133+ELCs的特性,研究人员进行了10x基因组学单细胞RNA测序,经过质量过滤,回收了10,869个细胞。采用K均值聚类算法,将CD133+ELCs进一步聚为CD133_1、CD133_2、CD133_3和CD133_4四组。有趣的是,虽然PromI在所有四个亚簇中都普遍表达,但编码髓过氧化物酶的Mpo基因主要表达在簇CD133_1中,Mmp9主要表达在簇CD133_4中。f.在伪时间轴上,簇CD133_1与ECs的相关性更强。g.研究人员进一步研究了CD133+ELCs的功能特性。已知EPCs摄取低密度脂蛋白(LDLs)和Ulex europaeus agglutinin 1(UEA-1)I。超过95%的新鲜FACS分离的CD133+ELCs对Dil-acLDL和UEA-1呈阳性,表明它们具有内皮潜能。h.为了研究CD133+ELCs在新生血管中的潜力,研究人员进行了离体Matrigel plug实验,CD133+ELC plugs显示出CD31+Cdh5+细胞的管状结构,这在CD133-BMNCs plugs中没有观察到。i.然后,研究人员利用磁激活细胞分选(MACS)富集来自ROSAmT/mG小鼠的CD133+ELCs和CD133-BMNCs,并通过尾静脉将它们静脉注射到给予FAL的小鼠体内。动态微循环成像系统分析显示,补充CD133+ELCs后,第14天的血流恢复率从50%显著提高到近85%,而CD133-BMNCs治疗后仅为65%。j.在损伤部位经常观察到供体来源的表达tdTomato的内皮细胞,约34.6±1.4%的CD31+细胞表达tdTomato阳性。k.特别值得注意的是,用CD133+ELCs和CD133+MPO+ELCs处理的小鼠,代表CD133_1簇,在FAL后第14天的血流恢复速度相当。


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图3

要点3:a.内皮功能障碍加速衰老,缩短了HGPS:Lmnaf/f;TC小鼠模型的寿命。研究人员假设内皮功能障碍是由EPCs缺陷引起的,而EPCs的补充可能会延长模型的寿命。为了验证这些假设,研究人员首先通过FACs分析了LmnaG609G/+和野生型(WT)对照小鼠中CD133+ELCs的数量。与对照小鼠相比,LmnaG609G/+小鼠中CD133+ELCs的数量显著增加。b.研究人员在FAL模型中富集CD133+ELCs并研究其在血管再生中的功能。与对照组相比,来自全球HGPS模型LmnaG609G/G609G小鼠的新生血管能力受损约30%,表明LmnaG609G/G609GCD133+ELCs的功能下降。c.研究人员探索了补充CD133+ELCs是否可以挽救Lmnaf/f;TC小鼠的新生血管。事实上,原位注射从ROSAmT/mG小鼠中分离的CD133+ELCs完全恢复了Lmnaf/f;TC小鼠的缺陷新生血管。d.LmnaG609G/G609G小鼠在2月龄时开始出现衰老特征,出生后4-6个月死亡。接下来,研究人员质疑年轻和健康的CD133+ELCs是否可以使衰老的血管恢复活力并改善早衰小鼠的早衰。为了验证这些假设,研究人员通过MACS富集了3个月大和健康的ROSAmT/mG小鼠的CD133+ELCs。然后,从3月龄(最早死亡事件发生前)开始,每周向LmnaG609G/G609G小鼠尾静脉注射1×106CD133+ELCs,连续1个月。通过荧光显微镜在心脏和肌肉中检测到供体来源的tdTomato+ECs,但在主动脉中未见。e-f.更重要的是,在LmnaG609G/G609G小鼠中补充EPC后,小梁数量显著增加,小梁间距显著减少。g.EPC治疗也减轻了早产儿体重减轻。h.最重要的是,早衰小鼠的平均寿命延长了近20%(从21周延长到25周)。


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图4

要点4:a.血管老化/功能障碍是衰老的标志;然而,其因果关系仍缺乏实验支持。有趣的是,与年轻小鼠(3个月大,Y)相比,老年小鼠(27个月大,O)的CD133+ELCs数量没有太大变化。b.但与ELCs(Y)相比,ELCs(O)的新生血管能力明显受损。c.与年轻小鼠相比,老年小鼠心脏和肌肉中的CD133+ELCs数量显著减少。d-e.研究人员研究了补充CD133+ELCs是否能增强新生血管能力。为此,每隔一周将3月龄ROSAmT/mG小鼠富集的1×106ELCs通过尾静脉注射到18月龄小鼠体内。ELC补充8个月后,腓肠肌毛细血管密度(CD31+ELCs)明显增加,从234.5±9.9mm-2增加到393.3±14.8mm-2(P<0.05),后者与幼龄小鼠(3月龄,409.9±13.1mm-2)相当。相应的,ELC处理后心脏毛细血管密度(CDH5+ECs)也显著增加,从2051.5±42.6mm-2增加到2532.9±157.4mm-2(P<0.05),这与幼龄小鼠(3月龄,2570.3±101.6mm-2)相似。特别有趣的是,研究人员在首次注射ELCs8个月后持续观察到心脏和肌肉组织中的tdTomato+细胞。f.接下来,研究人员分析了ELC处理的老年小鼠的整体衰老特征。骨体积(BV)与组织体积(TV)之比和骨小梁数量逐渐下降,而骨小梁分离/间距随着年龄的增长而增加。g.ELC治疗减轻了骨质流失的加剧,甚至达到了BV/TV(%)的显著性。ELC治疗也增加了跑步耐力。h.此外,体重没有变化,直到衰老后期,当未治疗的小鼠开始死亡。i.最重要的是,CD133+ELC补充后,中位寿命延长了10%,从115周延长至126周。此外,研究人员测试了CD133+MPO+和CD133+MPO-MMP9-ELCs亚群的寿命延长效应。明显地,CD133+MPO+ELCs也延长了寿命,其程度与CD133+ELCs相似。相比之下,CD133+MPO-MMP9-亚簇的补充仅略微增加了寿命,但没有达到显著性。


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图5

要点5:a.为了了解驱动ELC衰老和功能下降的潜在机制,研究人员从幼龄(3月龄)和老年(18.5月龄)小鼠中获得并比较了富含FACS的CD133+ELC的单细胞转录组。研究人员从年轻小鼠和老年小鼠中分别回收了8,362个细胞和10,597个细胞。b-c.非常有趣的是,三个基因,Fdps,Anxal和Tspo,在所有四个旧的ELCs集群中都显著且持续上调。d.这一点通过定量聚合酶链反应(PCR)进行了反转录验证:Fdps,Anxal和Tspo都在CD133+细胞中高表达。e.虽然老年小鼠CD133+ELCs和CD133-BMNCs中Anxal和Tspo的表达水平均显著增强,但Fdps在老年小鼠中的表达上调似乎更特异于CD133+ELCs。因此,研究人员将重点放在Fdps上进行进一步的机制研究。值得注意的是,CD133+ELCs比CD133-细胞增殖能力更强,因为CD133+ELCs中的Ki67水平远高于CD133-BMNCs,而CD133-细胞中的Ccnd1水平远高于CD133+细胞。Fdps编码法尼酯二磷酸合成酶(FDPS),是类异戊二烯生物合成的关键酶,催化法尼酯二磷酸3的形成。法尼基二磷酸是甾醇、醇、类胡萝卜素和泛醌的前体,也是蛋白质法尼化和香叶基基化的底物。f.二膦酸盐衍生物帕米膦酸盐(PAM)抑制FDPS活性,临床上用于治疗骨质疏松症。为了确定FDPS表达升高是否导致老年小鼠ELCs功能下降,研究人员构建了一种重组AAV血清型DJ(rAAVDJ)载体,该载体带有由普遍存在的CMV启动子驱动的FDPS表达盒。在CD133+ELCs中观察到FDPS过表达。g.在FAL模型中,FDPS过表达显著损害了来自幼鼠的内皮细胞形成新血管的能力。h.相比之下,PAM孵育可显著提高老年小鼠内皮细胞的新血管形成能力,而PAM与年轻内皮细胞联合处理则显示出最小的加性效应。因此,FDPS的增加会损害ELC在衰老过程中的功能。



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图6

要点6:a.接下来,研究人员研究了PAM处理的体内效应。为此,研究人员通过腹腔注射PAM(1mgkg-1体重)或载药(磷酸盐缓冲盐水,PBS)治疗22月龄雌性小鼠。治疗两个月后,研究人员发现PAM处理小鼠中CD133+ELCs的数量与对照小鼠相比显著增加。b.从PAM处理小鼠分离的CD133+ELCs中,衰老标记基因p16和Il-6均显著下调。c.研究人员还研究了PAM处理是否能增强CD133+ELCs的功能。为此,研究人员每周给18月龄雌性小鼠注射PAM(1mg kg-1),持续2个月。然后,采用流式细胞术分别从实验组和对照组小鼠中分离CD133+ELCs,分别于术后第1天和第7天通过尾静脉注射1×106个CD133+ELCs。事实上,与对照组小鼠相比,注射从PAM处理小鼠中分离的内皮细胞的小鼠的血流恢复率显著提高。d.接下来,研究人员探索了用长期PAM治疗抑制FDPS是否可以使衰老组织恢复活力并促进小鼠寿命。研究人员将年龄在90周(21个月)左右的老年雌性小鼠分为两组,分别通过腹腔注射PAM(1mg kg-1)或载体(PBS)。密切监测各组的健康状况和寿命。PAM治疗6个月后,心肌组织毛细血管密度(CDH5+ECs)由1,610.24±131.32mm-2显著增加至1,889.3±135.6mm-2(P < 0.05)。e.此外,在从暗到光的转变过程中,PAM处理的小鼠比未处理的小鼠表现出更快的活动到休息的转变。f.对于存活时间超过中位存活时间的小鼠(115周vehicle处理;122 周PAM处理);雌性小鼠的寿命从118.5±4.3周显著延长至128.4±3.52周(P=0.0371)。g.同样,研究人员研究了PAM对雄性小鼠的治疗效果。有趣的是,经PAM处理的雄性小鼠的中位寿命和最长寿命均显著增加(P=0.02)。h.如果两种性别结合在一起,寿命也会显著延长。因此,研究人员得出结论,PAM治疗可以延长小鼠寿命。



本文小结

综上所述,研究结果表明,在骨髓中,CD133标志着具有新生血管潜力的内皮细胞。健康和年轻的CD133+ELCs可以使衰老的血管恢复活力,改善衰老特征,并促进早衰和生理衰老小鼠的寿命。在分子水平上,强调了以FDPS为中心的甾醇代谢途径在调节ELC衰老/功能障碍和长寿中的关键作用。筛选针对FDPS通路的化学物质可能有益于健康和长寿。同时,还暗示了使用基于干细胞的治疗策略治疗早衰症和抗衰老应用的潜力。



参考文献:Sun, S., Meng, Y., Li, M. et al. CD133+ endothelial-like stem cells restore neovascularization and promote longevity in progeroid and naturally aged mice. Nat Aging 3, 1401–1414 (2023). https://doi.org/10.1038/s43587-023-00512-z


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