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IF 16.6 nature communications│剪接体成分Usp39通过调节自噬参与肝脏脂质稳态

IF 16.6 nature communications│剪接体成分Usp39通过调节自噬参与肝脏脂质稳态



前言

2023年11月3日,山东大学基础医学院与苏州大学转化医学研究所等研究小组在nature communications上发表了题为“Spliceosome component Usp39 contributes to hepatic lipid homeostasis through the regulation of autophagy”的研究论文,研究发现Usp39介导的AS是维持肝脏自噬和脂质稳态所必需的。


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背景介绍

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是最常见的肝脏疾病,全球患病率为25%。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一种更为严重的NAFLD亚型,目前是导致肝移植的第二大原因。NAFLD中缺陷性自噬的参与表明,增强自噬可以改善脂肪肝疾病。Usp39参与了各种癌症的发展。Usp39缺陷小鼠表现出早期胚胎死亡和异常的顶基极性,但Usp39在肝脏中的生理和病理功能在很大程度上仍然未知。

图文解析



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图1

要点1:a-b.为了识别U4/U6的组件。U5 tri-snRNP复合物参与脂肪肝疾病的发展,研究人员分析了编码16个核心U4/U6的基因的mRNA水平。利用GEO数据库(GSE165855)中食粮和HFD喂养小鼠肝脏的转录组学数据,以及GEO数据库(GSE154892)中另一组食粮和CDAHFD喂养小鼠肝脏的U5 tri-snRNP成分。其中,在HFD和NASH小鼠的RNA-seq数据中,Usp39和Ddx23均显著下调。c.接下来研究人员对16个U4/U6进行交互网络分析。使用两个RNA-seq数据集分析U5 tri-snRNP成分,发现Usp39是NAFLD和NASH小鼠肝脏中与U5 snRNP和U4/U6 snRNP成分相互作用最强烈的枢纽因子之一。d.有趣的是,在人类NAFLD患者队列(GSE193084)中,USP39表达与NAFLD活动评分呈负相关。e.然后研究人员将重点放在USP39上进行进一步研究。分析了人类NAFLD患者队列中USP39的表达水平,发现与低NAFLD活动评分组相比,高NAFLD活动评分组USP39明显下调。f.与此同时,USP39水平在纤维化晚期(2-4)低于纤维化早期(0-1)。g-h.接下来,研究人员通过免疫印迹和qPCR检测了其在HFD喂养和蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)喂养小鼠肝脏中的表达,与食物喂养的对照组小鼠相比。HFD喂养和MCD喂养的小鼠肝脏中Usp39的表达水平明显低于正常小鼠。i.重要的是,与非NASH患者相比,NASH患者肝脏中USP39的表达也有所降低。j.免疫组化染色发现Usp39主要定位于细胞核,并且在HFD和MCD喂养的小鼠中,Usp39的蛋白水平显著降低


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图2

要点2:a-b.为了探索Usp39在肝脏发育和稳态中的作用,研究人员通过将Usp39fl/fl小鼠与Alb-Cre小鼠杂交,产生肝脏特异性Usp39敲除小鼠(Usp39- HKO)。c-d.Usp39-HKO mice在出生后4至8周期间体重明显下降。e-g.在5周龄时,Usp39-HKO小鼠的体重、肝脏重量和肝脏/体重比也有所降低。h.H&E染色显示,与对照组相比,Usp39-HKO肝脏中心静脉纤维化,双核细胞数量减少。h-j.研究人员还观察到,与对照组相比,Usp39-HKO肝脏中增殖标志物(Ki67和Pcna)肝细胞增殖的表达增加。k-m.值得注意的是,Afp和H19(祖细胞标记物)的mRNA表达显著增加,而白蛋白表达降低。n.研究人员还检测了肝功能的几种标志物(ALT、AST、LDH、白蛋白水平和免疫细胞浸润)。结果显示,在5周龄时,Usp39缺失引起自发性肝损伤,表现为ALT、AST、LDH水平升高,Alb水平降低。o-p.通过天狼星红染色和纤维化标志物的qPCR分析评估Usp39的缺失诱导肝纤维化。在这个年龄的Usp39-HKO小鼠中未发现凋亡细胞、炎症细胞和祖细胞活化。结果显示,Usp39缺失在5周龄时诱导自发性肝损伤。n-p.有趣的是,与5周龄Usp39-HKO小鼠相比,10周龄Usp39-HKO小鼠的肝损伤明显减轻。


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图3

要点3:a.为了确定肝脏Usp39在肝脏稳态和功能中的具体作用,研究人员在12月龄时检测了Usp39-HKO和对照小鼠。有趣的是,Usp39-HKO小鼠脾脏肿大,肝脏呈浅色, b .H&E染色和天狼星红染色均可见大量大脂滴积聚和纤维化。c.与此一致,Usp39-HKO小鼠的肝脏TG水平高于对照组。d.此外,炎症和纤维化基因(Col1a1、a-Sma、Tnf-α和Tgfb1)普遍上调。e-f.为了进一步阐明Usp39在肝脂肪变性中的作用,研究人员对Usp39-HKO小鼠和对照小鼠进行了为期12周的HFD喂养。HFD喂养的Usp39-HKO小鼠表现出更明显的肝脏脂肪变性和纤维化形成。g-h.肝脏TG水平和炎症和纤维化基因mRNA表达也更为显著地增加。此外,Usp39-HKO和对照小鼠接受MCD饮食治疗5周。i-j.研究人员发现与对照小鼠相比,Usp39-HKO小鼠的TG、二甘油酯(DG)、磷脂酰肌醇(PIP2)和鞘碱(So)显著增加。k-n.联合脂质组和转录组分析显示,Usp39-HKO小鼠的肝纤维化和脂肪变性高度富集。


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图4

要点4:a.自噬在肝脏脂滴降解中起着关键作用,研究人员对脂质组和转录组数据的Ingenuity Pathway 分析显示,与对照组相比,Usp39-HKO肝脏中自噬、TG降解和脂肪酸β-氧化(Fatty Acid β-oxidation, FAO)通路显著减弱,而mTOR信号通路被激活。b.研究人员假设Usp39缺失可能会阻断自噬,从而增加肝脏中脂滴的积累:为了探索这一点,通过qPCR评估了自噬相关基因的表达,发现与对照组相比,Usp39-HKO肝脏中Ulk1、Atg3和Atg7显著下调。c.在AML12细胞(小鼠肝细胞细胞系)和原代肝细胞中,Usp39敲低后Ulk1、Atg3和Atg7的mRNA水平一致降低。d-f.此外,免疫印迹显示,敲除或敲低Usp39后,Ulk1、Atg7和LC3 II降低,p62升高。g.在电镜下,Usp39-HKO肝脏中自噬囊泡的形成明显减少。h.此外,Plin2和Lamp2的共免疫荧光染色显示Plin2的丰度增加,Lamp2的分布减少。i.同样,在Usp39缺失后,原代肝细胞和AML12细胞中的EGFP-LC3点显著减少。j.重要的是,原代细胞和AML12细胞中Usp39的敲低减少了与BODIPY C12染色的脂质共定位的EGFP-LC3点的数量。


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图5

要点5:a.鉴于Usp39是U4/U6的一个组成部分。U5 tri-snRNP,研究人员假设Usp39的缺失可能会破坏肝脂质自噬所需基因的RNA剪接。为此,研究人员对Usp39-HKO和对照小鼠的肝脏组织(n = 4)进行了RNAseq检测。使用rMATs软件进行AS事件分析,共检测到1472个基因的1993个剪接事件。Usp39缺失的主要AS事件是外显子跳变(55%)、5'剪接位点替代(12%)和内含子保留(12%)。b.热图显示了Usp39-HKO小鼠与对照组相比肝脏组织中自噬相关基因的差异表达,c.并构建了火山图来显示Usp39缺乏时AS事件的差异分布。d.为了确定Usp39的全基因组结合位点和靶点,研究人员在AML12细胞中进行了RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)。RNA的超声破碎和严格的洗涤条件提高了结合信号的特异性和分辨率。RIP峰分布分析显示,Usp39主要定位于内含子(29%)、外显子(18%)和3' UTRs(19%)。e.对RIP-seq数据进行Motif富集分析,发现GGCCAC和GCCAUA是两个最丰富的元素。f.为了鉴定Usp39调控的AS候选靶点,研究人员利用RIP-seq和RNA-seq数据整合了Usp39结合基因和AS相关基因,鉴定出611个常见基因。g.对611个基因进行基因本体分析发现,与细胞分解代谢过程、剪接体复合体组装、肽酰丝氨酸磷酸化和自噬调控相关的通路显著富集。h-l.为了确定由Usp39调控的肝脏脂质积累的功能靶点,研究人员检测了自噬相关基因的AS模式,这些基因富集于Usp39结合和选择性剪接的转录本中,包括Ulk3、Nrbp2、Tcirg1、Trp53inp1和Hsf1。然后,研究人员通过AS和结合峰分析以及RT-PCR验证了这些基因剪接的改变。


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图6

要点6:a-b.研究人员接下来关注Hsf1,热休克反应的主要转录调节因子,它能促进细胞保护性自噬。分析了Hsf1的剪接事件,发现Usp39的破坏导致外显子6的5'剪接位点选择,这引入了一个过早终止密码子(PTC),可能导致无义介导的mRNA衰变(NMD)。c.事实上,通过半定量RT-PCR在Usp39-HKO肝脏中证实了Hsf1剪接的改变。d.miniigene剪接实验进一步证实Hsf1剪接结果的改变随着Usp39添加量的增加而降低,但当Usp39缺失时增加。e.随后,研究人员通过qPCR分析Hsf1在肝组织中的典型异构体和NMD异构体,发现在Usp39缺失后,典型异构体显著减少,而NMD异构体显著增加。f.为了验证NMD亚型通过NMD途径被降解,研究人员测量了NMD亚型在Upf1敲低和放线菌素d处理的AML12细胞中的RNA半衰期,与对照组相比,在Upf1敲低细胞中,Hsf1亚型的NMD半衰期显著增加。g.为了进一步证明Usp39与Hsf1的直接结合,研究人员在过表达FLAG-Usp39的AML12细胞中进行了RIP实验。RIP-qPCR显示Usp39结合在Hsf1外显子6附近的四个位点。h. RNA pull-down实验进一步显示生物素标记的Hsf1探针成功下拉了Usp39。i-k.研究人员进一步发现,在饲养、禁食和高热量饲养条件下,Usp39耗尽后,Hsf1、Ulk1、Atg7和LC3 II蛋白水平显著降低,p62蛋白水平升高。l-m.此外,研究人员观察到HFD喂养和MCD喂养的小鼠肝脏中Hsf1蛋白水平较低。n.最后,与非NASH患者相比,NASH患者肝脏中也检测到HSF1表达降低。


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图7

要点7:a-b.研究人员进行了援救实验,以确定Hsf1的下调是否介导了Usp39缺失导致的脂质积累。在AML12细胞中,BODIPY染色显示,通过强制表达Hsf1可以挽救Usp39缺失引起的脂质积累。c.Plin2和Lamp2染色的免疫荧光进一步显示,在AML12细胞中,通过强制逆转Hsf1表达,可以恢复Usp39缺失引起的受损自噬。d.免疫印迹显示,在AML12细胞中,特别是在血清饥饿状态下,强制表达Hsf1可以挽救Usp39缺失导致的自噬受损。e.然后用表达Hsf1或空载体的腺病毒感染这些小鼠,然后进行4周的正常饮食。异位Hsf1表达明显减轻了Usp39缺失引起的肝脂肪变性。f-g.通过Plin2和Lamp2的免疫染色和自噬相关基因的免疫印迹可以证实,Usp39缺失导致的自噬受损得以恢复。


本文小结

综上所述,本次研究表明,Usp39在肝功能中具有重要生理作用。在人类NASH患者和NAFLD/NASH小鼠的肝脏中,Usp39明显下调;肝细胞中Usp39的缺失导致自噬缺陷和脂质积累,从而在小鼠中导致自发性脂肪肝。在机制上,Usp39调节自噬相关基因的选择性剪接,包括热休克转录因子(HsfI)。Usp39的缺失导致HsfI的一个异构体通过无义介导的mRNA降解而被降解,进而导致自噬功能受损和肝脏脂肪积累。因此,研究结果表明,通过调控剪接选择性,Usp39维持了执行自噬所需基因的表达,从而维持肝脏脂质稳态。


参考文献:Cui, D., Wang, Z., Dang, Q.et al. Spliceosome component Usp39 contributes to hepatic lipid homeostasis through the regulation of autophagy. Nat Commun14, 7032 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-42461-6


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