细胞增值和凋亡

细胞增值和凋亡

细胞增殖检测(CCK-8/MTT)

服务流程:

1.细胞培养与接种

2.药物处理

3.MTT/WST-1/CCK-8检测

4.数据分析

客户提供：

待测细胞，需冻存后干冰或液氮运输，也可复苏后常温寄送；

待检测的药物或蛋白样品，需干冰运输，冻干样品可4℃寄送。

结果交付：

实验原始数据、分析结果；实验流程及完整报告一份。

一、MTT检测法

分子式C18H16N5SBr，也叫噻唑蓝。

在MTT检测中，细胞是死是活主要看线粒体内的脱氢酶有没活性，那怎么知道它有没活性？

这时噻唑蓝就需要为脱氢酶验明正身。如果线粒体内的脱氢酶有活性，他就能将黄色的蓝姑娘（MTT）分解成兰紫色的水不溶性的甲瓒，并沉积在细胞中，死细胞无此功能。然后二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数和细胞活力成正比。

MTT注意事项：

1. 选择合适的细胞接种浓度。进行预实验检测其贴壁率，倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定实验每孔的接种细胞数和培养时间，以避免OD值过高或者过低；

2.   MTT粉末4℃下避光保存，MTT工作液现配现用（工作浓度 5mg/ml ），当MTT溶液变成灰绿色时不建议使用；

3.   MTT有致癌性，用的时候要小心，操作是戴好手套；

4.   加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会被吸走，可在这之前先用平板离心机离心96孔板，2000rpm 5min，然后吸掉上清。

二、CCK-8检测法

CCK-8就是MTT的升级版， CCK-8细胞活性检测试剂中含有WST-8——一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以为线粒体内的脱氢酶验明正身，在脱氢酶作用下，还原生成橙黄色的甲瓒产物。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

CCK-8注意事项：

1.CCK-8试剂在-20℃下避光保存；

2. 若暂时不测定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1M的HCI，培养板避光在4℃冰箱中保存，24小时内测定，吸光度变化较小；

3. 培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，一般情况下，最外一圈的孔加培养基或者PBS，不作为测定孔用；

4. 确保每个孔内没有气泡，以免影响结果否则会干扰测定；

5.   CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。

三、TUNEL法检测细胞凋亡（适用于细胞晚期凋亡检测）

服务流程:

1.标本预处理

2.内源性过氧化物酶灭活

3.TdT酶反应

4.生物素标记

5.染色

6.封片观察

凋亡（Apoptosis），或者说程序性细胞死亡（Programmed cell death），是细胞内建的防御机制之一，在生物的正常发育及疾病抵御中起到重要的作用。凋亡过程与通路的异常，会导致多种疾病，包括肿瘤。

“凋亡”最早是一个细胞形态学概念。因此，鉴定凋亡的金指标，往往是基于形态学的。

凋亡和另外一种主要的细胞死亡类型“坏死”（Necrosis）有着显著的亚细胞形态差异。简而言之，在透射电镜下，凋亡细胞染色质浓聚，通常沿核膜分布；整体细胞形态发生变化，如细胞表面微绒毛状突起消失，细胞间接触消失，细胞质浓聚，形成具有膜结构的包裹着胞浆内容物和核物质的凋亡小体；相比坏死，凋亡细胞的核结构直到晚期才会解体。典型图片如下图：

既然凋亡细胞其中一个形态学特征是染色质浓聚，且细胞核结构在凋亡后期崩解，那么观察核形态也是较为直接的指标。相比其他形态学指标来说，观察细胞核形态不需要电子显微镜，而只需用荧光染料配合普通的荧光显微镜即可。典型实验结果如图所示。

一般而言，核形态染色采用的是DAPI和Hoechst系列荧光染料。因为这些染料特异性强，荧光性能好。其中，Hoechst 33342是最为方便的染料。它可自由穿透细胞膜，直接对核染色，而不需要固定、破膜步骤。因此，Hoechst 33342还能结合形态学的相差图像，以及其他活细胞染料（如用7-AAD等染细胞膜破裂的细胞），同时对多个指标进行定量。

除了实验操作简单、成本低廉之外，核形态染色的优势还在于它是一个定量指标。因此，这也是我最常用的凋亡检测指标之一。不过，定量依赖于拍摄照片后对多个视野的不同核形态手动计数。数细胞费劲，算得上是这项技术的最大缺陷。如图所示：

在正常细胞中，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）位于胞浆侧。细胞凋亡中期，PS外翻。Annexin V是一种Ca2+依赖的对PS具有高度亲和力的磷脂结合蛋白，因此可以用荧光标记的Annexin V检测PS的外翻。凋亡末期，细胞膜结构受损，原本不透膜的核酸染料（如PI、7-AAD等）也能进入细胞，从而产生信号。分别检测Annexin V和不透膜核酸染料的信号，可对凋亡中期和末期细胞的比例进行定量。

这是一项针对细胞膜的检测，为了上流式，我们必须制备单细胞悬液。然而，受到凋亡刺激的细胞，细胞膜通常比较脆弱。因此在制备贴壁细胞样品时，需特别注意在消化和吹打时的操作，避免额外损伤。如图所示：

细胞凋亡途径，是由一套明确的信号通路层层调控的。在绝大多数情况下，所有的凋亡信号都会汇集到凋亡的最终执行者Caspase-3之上。上游的凋亡信号通过切割Caspase-3，使其具备酶活，并执行最后的凋亡程序。就是用抗体去做Western blot，免疫组化或免疫荧光，进行定性或相对定量。如图所示：凋亡分子标记检测（WB免疫荧光）