IF 50.3 Cancer Cell|体内巨噬细胞工程化改造重塑肿瘤微环境根除癌症肝转移

前言

2023年11月13日意大利圣拉斐尔科学研究所（IRCCS San Raffaele Scientific Institute）Mario Leonardo Squadrito教授课题组在Cancer Cell在线发表题为“In vivo macrophage engineering reshapes the tumor microenvironment leading to eradication of liver metastases”的研究论文。研究人员描述了一种慢病毒载体（LV）平台，用于选择性地改造肝巨噬细胞，包括Kupffer细胞（KCs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），将I型干扰素（IFNα）输送到肝转移。

背景

癌症肝转移与目前的药物治疗（包括免疫疗法）反应不佳有关。基于基因的IFNα递送延迟小鼠结肠直肠和胰腺导管腺癌肝转移的生长。对IFNα的反应与TAM免疫激活、增强MHC II限制性抗原呈递和减少CD8+T细胞的耗竭有关。相反，IL-10信号传导增加、Eomes CD4+ T细胞的扩增、显示I型调节性T（Tr1）细胞特征的细胞类型和CTLA-4表达与治疗耐药性相关。通过组合CTLA-4免疫检查点阻断和IFNα LV递送靶向调节性T细胞功能，扩展肿瘤反应性T细胞，在大多数小鼠中获得完全反应。这些发现支持了一种有前景的治疗策略，该策略可用于未满足医疗需求的患者。

图1

要点1：A.MRC1在包括KCs在内的大多数巨噬细胞亚群中表达，并被可选活化的巨噬细胞(如TAM)上调然后，克隆了Mrc1启动子序列下游的GFP编码序列(起源于Mrc1。GFP LV)，产生Mrc1。B-D.静脉注射Mrc1。免疫受损小鼠的GFP LV导致肝细胞(KCs和肝窦内皮细胞，LSECs)和一些脾细胞(Mrc1阳性巨噬细胞)中GFP选择性表达。没有在血细胞、骨髓或其他器官如肺、髂下淋巴结、小肠和脑中观察到GFP表达或整合的LV拷贝。基于这些结果，在Mrc1中加入了GFP下游的miRT-122-5p和miRT-126-3p各4个拷贝。GFP LV生成Mrc1.GFP。miRT LV。然后，通过肝内注射植入表达mCherry的MC38结直肠癌细胞，或从APC△716、KrasG12D;Tgfbr2-/-;Trp53R270H;Fbxw7-/-小鼠，这里称为AKTPF CRC细胞，通过脾内注射，以更好地将多灶转移播种到肝脏。静脉注射了Mr。GFP或者Mr.GFP.miRT LV对肝转移小鼠的影响。E.与研究人员在无肿瘤小鼠中的发现一致，Mrc1。在肝脏巨噬细胞、LSECs和脾脏Mrc1阳性巨噬细胞中，GFP驱动GFP的表达，而在miRNA的调控下(Mrc1.GFP.miRT LV)， LSECs中GFP的表达几乎完全减弱。F-G.在MC38-和AKTPF-来源的转移性病变中，发现GFP+细胞在肝脏转移周围区域富集，特别是在F4/80+ VSIG4+和F4/80+ CLEC4F+ KCs中，表明该区域KCs中Mrc1启动子活性的优先转导和/或上调。值得注意的是，F4/80+ CLEC4F-或F4/80+ VSIG4- -巨噬细胞中也有一小部分GFP+细胞，它们在肿瘤内占主导地位，可能代表单核细胞来源的TAM。综上所述，新开发的Mrc1.GFP在肝巨噬细胞中的选择性生物分布和表达。miRT LV及其在肿瘤病变周围区域的富集表达，支持了体内基因工程肝巨噬细胞(包括KCs和TAM)向肝转移病变输送治疗性分子的可行性。

图2

要点2：A-B.在体内通过静脉注射IFNα LV或具有相同调控元件但缺乏转基因的LV(这里为对照LV)来改造肝巨噬细胞，以免疫能力小鼠的剂量范围高效靶向肝细胞在携带IFNα LV工程肝巨噬细胞的小鼠中，通过检测血浆中IFNα浓度的增加，观察到快速的转基因输出，在3周后达到700-1,000 pg/mL的峰值，此后稳定在200 - 700 pg/mL之间。C.与对照组LV组相比，这些IFNα水平在240天内保持稳定，并最终在360天降至几乎无法检测到的水平。IFNαLV处理小鼠肝脏中每个基因组的整合LV拷贝数低于对照组LV处理小鼠，这表明IFNα LV转导的肝细胞存在长期的反选择。D.与对照组LV处理的小鼠相比，IFNα LV处理的小鼠随着时间的推移显示循环B细胞和嗜酸性粒细胞数量减少。驻留的单核细胞、红细胞和血红蛋白水平也有轻微下降。E.此外，没有观察到肝脏或组织损伤指标(即丙氨酸转氨酶ALT和天冬氨酸转氨酶AST)水平的改变，这表明IFNα LV处理小鼠没有肝毒性。F.为了进一步研究肝巨噬细胞外源性IFNα表达是否会引起炎症、组织损伤或其他改变，研究人员在实验结束时对大多数相关器官进行了组织病理学分析。在分析的任何隔室中均未观察到与治疗相关的异常。综上所述，这些结果表明，肝巨噬细胞驱动的IFNα表达导致血浆IFNα的稳定和长期水平，这在小鼠中是安全且耐受性良好的。

图3

要点3：A.系统地给予2种不同剂量(1.5*109或1.5*1010TU/kg)的IFNα LV来改造小鼠的肝巨噬细胞，这些小鼠先前受到基于MC38的实验性肝转移的攻击。B.发现血浆中持续的剂量依赖性IFNα水平以及肝脏中整合的剂量依赖性LV拷贝，以及IFNα LV处理小鼠血浆中IFNα水平与循环B细胞数量之间的负相关。C-D.发现，两种剂量的IFNα LV均可延缓肿瘤进展，并在3只小鼠(1只低剂量，2只高剂量)中实现完全缓解(CR)和长期生存。E-G.进行了剂量响应实验，IFNα LV的剂量范围为5*108 TU/kg至4*1010 TU/kg。观察到血浆中IFNα输出和肝脏中每个基因组LV拷贝量的LV剂量依赖性增加，以及肝脏转移量的显著减少，同时表达炎症表型标记物的TAM比例增加。然后，对患有AKTPF肝转移的小鼠进行了另外两个独立的实验，使用5*109 TU/kg的剂量，选择这个剂量是因为在比较抗肿瘤效果和全身IFNα暴露时，它提供了最好的治疗指标。H-J.在2个实验中，20只小鼠中有8只IFNα LV延迟肿瘤进展并导致CR。K-M.根据研究人员之前在MC38实验转移模型中的发现，观察到TAMs偏向炎症表型，肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞数量增加。N-O.还观察到，在CD8+T细胞耗竭的AKTPF肝转移小鼠中，IFNα抗肿瘤功效发生逆转。P.然后，研究了工程化巨噬源IFNa对肝内注射KrasG12D;Trp53R172H PDAC细胞(K8484)引起的肝转移的影响发现，与对照组相比，IFNα LV组10只治疗小鼠中有5只肿瘤生长受到强烈抑制。总之，这些结果表明，通过全身传递IFNα LV的肝巨噬细胞工程，至少在一定程度上通过促进炎症性TAM表型和CD8+T细胞反应的激活，强有力地抑制来自不同肿瘤类型的肝转移。

图4

要点4：A.然后，根据其与转移灶/肝实质边界的相对距离，将空间点分组为不同的空间区室，包括内转移灶(空间区室A-C)、前转移灶(空间区室D)、周围转移灶(空间区室EG)和完整肝区(空间区室H)。B.与这一观察结果一致，上皮细胞相关基因，如Epcam、钙粘蛋白1(Cdh1)和绒毛蛋白1(Vil1)在内部和前部转移区高度表达。相反，肝细胞相关基因(如白蛋白、白蛋白;Apoa2和Cyp27a1)以及属于肝脏相关通路的基因集(例如，脂肪生成或胆汁酸代谢)在完整肝脏区域上调。C.值得注意的是，与T细胞耗竭和耐受性表型相关的标志物，如Tgfb1、Eomes和Gzmk，在耐药组的内部、前部和转移周围区域也上调。总之，肝巨噬细胞表达IFNα与应答小鼠肝转移和转移周围区域的选择性免疫激活有关。然而，在耐药小鼠中，与应答者相比，免疫激活似乎受到抑制，并且与转移/肝实质边界区域IL-10信号的富集有关。

图5

要点5:A.与耐药组或对照组相比，部分应答组中与抗原呈递相关的基因，即MHC蛋白复合物、抗原加工和呈递相关的基因表达上调，并且在对照组中表达最低。基于这一观察结果，并考虑到IFNα对TAM遗传程序的主要影响，研究人员将所有属于IFNαLV治疗肿瘤中存在的集群的TAM称为IFNα-TAM，而存在于对照LV队列中的TAM称为TAM。B.所有其他细胞簇根据其基因表达谱进行手工注释。C-D.通过对TAM亚群之间的差异基因表达分析，发现在所有三个队列中，与TAM相比，IFNα-TAM中上调的基因在与IFNα/IFNγ反应相关的生物过程中富集，如Stat1、Socs1和Nlrc5;TNFα信号;LPS激活;抗原加工和递呈，如MHC亚基(H2-D1和H2-Ab1,CD74)，CD40和Tap1，与IFNα-TAM在积极调节免疫激活中的作用一致。另一方面，通常与TAM原肿瘤活性相关的原肿瘤基因，如Mmp8、Tmem176B、Trem2和Fn1在TAM中与IFNα-TAM相比上调。E.值得注意的是，与耐药组和对照组相比，应答组中的专业APC，即经典树突状细胞(CDC)和单核细胞来源的DC(Mo DC)丰富。F.与IL-10在抵抗肝巨噬细胞来源的IFNa表达中可能发挥的作用一致，与应答组和对照组相比，耐药的APC中IL-10相关基因，如Tgfb、Cebpb、Il4r、Socs3和Ccl24上调。G.另一方面，与MHC-I限制性抗原呈递相关的基因上调可能是由IFNα的直接作用引起的。综上所述，肝巨噬细胞释放的IFNα通过增强抗原提呈功能，促进APC向免疫刺激表型重塑。然而，与应答小鼠相比，耐药小鼠的MHCII限制功能和DC浸润似乎有所减少。同时，来自耐药小鼠的APC中IL-10信号传导增强，暗示对IFNα缺乏反应、IL-10上调和MHCII限制性抗原呈递受损之间存在关联。H.通过使用来自单细胞分析或已建立的KC标记的基因特征，对图4中的空间转录组学数据进行了反卷积，发现TAM特征在肿瘤内部(区域A至D)和区域中得分最高向健康实质(E至H区)移动时急剧下降，而肿瘤内的KC特征评分较低，在转移周围(E至G区)和完整组织(H)中升高，与图1的生物分布分析一致。有趣的是，在IFNa LV处理的小鼠中，KC标记评分在所有肿瘤区域都较高，并在转移周围区域达到峰值，这表明这些细胞的募集、激活或增殖增强。

图6

要点6：A.与TAM类似，IFNa和IFNg信号的基因在所有IFNa LV处理的队列中都富集。相反，属于免疫激活的基因(即T细胞介导的细胞毒性、自然杀伤细胞激活或细胞杀伤调节)仅在部分应答队列中上调。B.然后，进行了无监督的亚聚类分析，以识别T细胞和NK细胞区室内不同的细胞群，并手动注释所得到的聚类。在所有三个实验队列中发现重叠的细胞团。C.在耐药小鼠中，选择性地观察到一群调节性CD4+T细胞，其转录类似于先前描述的Tr1细胞(以下称为Eomes CD4+ T细胞)表达CD4+T细胞衰竭标志物，如Ctla4、Gzmk、Lag3和PD-1(Pdcd1)，以及与免疫抑制相关的基因，如IL-10受体(Il10ra)、Il10和转录因子Eomes，缺乏转录因子Foxp3的表达。D.另一方面，在应答者队列中选择性富集，观察到CD8+T效应1细胞群。E.后者表现出类似于组织驻留效应记忆T细胞的转录组特征，这在以前与免疫治疗反应有关此外，与对照组相比，肝巨噬细胞释放的IFNa增加了CD8+T细胞上的IFNa和IFNg信号传导。值得注意的是，与T细胞衰竭相关的基因，如Pdcd1、Lag3、TIM-3(Havcr2)、Ctla4、Eomes、Tox、Ccl3、Ccl4和Casp3，在应答小鼠中与对照或抗性小鼠相比下调。相反，与适应性免疫反应和T细胞介导的免疫和细胞毒性相关的基因，如Tcf7、Tbx21、Cd69、Itgae、Itga1、Cd7、Il2和Tnf，在应答小鼠中比在耐药小鼠中上调得更多。总之，这些数据表明，工程巨噬细胞释放的IFNα通过重塑与免疫治疗反应相关的T细胞浸润富集效应表型，同时抑制T细胞衰竭，从而促进了应答小鼠的适应性免疫。相反，在耐药小鼠中，浸润的Eomes CD4+ T细胞和增强的CD8+T细胞衰竭可能会阻止抗肿瘤作用。

图7

要点7：A-B.为此，使用了从中心收集的人类结直肠癌肝转移患者的大量RNA测序数据，发现IFNα信号评分较高的患者表现出更高水平的Tr1特征评分。C.然后，利用纳米链RNA技术分析了结直肠癌肝转移患者的肝周围转移区和转移区。与大量RNA结果和小鼠数据一致，观察到IFNα评分与Tr1评分、CTLA4表达和HLA-C表达在转移周围和转移区域呈正相关。D.此外，参与抗原呈递、免疫细胞活化或其他IFNα刺激基因的基因，不包括在用于计算IFNα评分的特征中，与IFNα评分呈正相关。E.观察到，与IFNα低水平组相比，IFNα高水平组中LAG3+ CD4+ T细胞浸润患者转移灶的百分比更高。F.值得注意的是，LAG3曾被报道为T细胞衰竭和人类Tr1细胞的标记物然后，对IFNα高信号组的两名患者进行了病例研究分析，观察到存在三阳性LAG3+ EOMES+ CD4+ T细胞和CTLA-4+ CD4+ T细胞浸润肿瘤。与这一发现一致，IFNα高的CD4+ T细胞表达CTLA-4的百分比高于IFNa低的组。总的来说，这些发现表明Tr1样细胞以及CTLA-4的表达与内源性IFNα信号传导呈正相关，并且可能至少部分地抵消TME中的免疫激活。

图8

要点8：A-B.然而，IFNα与a-IL10R联合使用的治疗效果低于IFNαLV，这表明IL-10信号可能是IFNα治疗活性发挥的必要条件。C.此外，Ctla4在耐药小鼠的CD8+T细胞中强烈上调。值得注意的是，Tr1细胞中的CTLA-4可能在抑制T细胞功能以及通过隔离抗原来减弱抗原呈递方面发挥关键作用CD80/CD86在APCs中的共刺激分子基于这一观察结果，研究人员将基于肝巨噬细胞的IFNα递送与抗Ctla-4阻断单克隆抗体给药方案结合起来(a-CTLA-4)。D-E.在两种不同的结直肠癌肝转移实验模型MC38和AKTPF中，与单独治疗相比，肝巨噬细胞联合IFNα与a-CTLA-4强烈抑制肝转移生长。F-G.在T细胞区室中，观察到活化的CD8+T细胞的扩增，这种扩增被a-CTLA-4联合治疗强烈增强。这些CD8+T细胞表现出肿瘤反应性衰竭细胞的特征，这表明该细胞簇与超扩增的TCR克隆型和几种激活/衰竭标记物如PD-1(Pdcd1)、TIM-3(Havcr2)、Ifng、CD39(Entpd1)、Itga1、Cxcr6和Prf1的表达相关。H.联合治疗还增加了这些扩增的T细胞的TCR克隆多样性，可能是通过重塑的髓细胞室促进抗原呈递。I.为了证实IFNa LV和a-CTLA-4联合治疗对结直肠癌转移的影响，在PDAC肝转移小鼠(K8484细胞)中进行了挑战。尽管IFNa LV和a-CTLA-4单独治疗都能有效抑制转移瘤生长，但在所有治疗小鼠中，只有它们的联合治疗才能达到完全CR。总的来说，这些发现证明了通过工程肝巨噬细胞从肿瘤床内递送基于基因的IFNα策略与靶向调节性T细胞功能的CTLA-4阻断之间的强大协同作用。

小结

综上所述，描述了一种肝巨噬细胞导向的基因转移策略，该策略在单次耐受性良好的静脉输注表达IFNα的LV后，通过实现先天和适应性免疫激活，快速促进对CRC和PDAC肝转移的不同小鼠模型的治疗反应。总的来说，该研究为临床开发基因治疗策略奠定了基础，该策略有可能解决肝转移患者目前未满足的医疗需求。

参考文献：Kerzel T, Giacca G, Beretta S, et al. In vivo macrophage engineering reshapes the tumor microenvironment leading to eradication of liver metastases. Cancer Cell. 2023;S1535-6108(23)00347-1. https://doi.org/10.1016/j.ccell.2023.09.014