IF 17.1 ACS Nano│MicroRNA-200负载脂质纳米颗粒促进典型MicroRNA缺陷小鼠的肠上皮再生

IF 17.1 ACS Nano│MicroRNA-200负载脂质纳米颗粒促进典型MicroRNA缺陷小鼠的肠上皮再生

前言

2023年11月8日，中国科学院广州生物医药与健康研究所在ACS Nano在线发表题为“MicroRNA-200 Loaded Lipid Nanoparticles Promote Intestinal Epithelium Regeneration in Canonical MicroRNA-Deficient Mice”的研究论文，研究表明，miR-200/p53通路是miR-200家族水平降低的活动性UC患者的一个有希望的治疗靶点。此外，LNP-miRNAs的临床应用可以提高现有肠道疾病治疗方式的有效性、安全性和可接受性。

背景介绍

肠上皮对各种类型的损伤具有快速再生的能力。这种再生能力受肠隐窝中发现的多个茎和祖群体的调节。ISCs通过沿隐窝绒毛轴产生所有类型的细胞，对维持肠上皮的稳态至关重要。暴露于辐射和化疗药物可以消耗肠上皮中活跃增殖的ISCs和转运扩增(TA)细胞。Lgr5标记了肠内的ISCs，这些Lgr5+ ISCs对急性损伤后的肠再生至关重要。miRNA是短的非编码RNA，长度约为22个核苷酸。它们与靶miRNA的3 '非翻译区(3 '-UTR)结合，导致转录后基因沉默。DGCR8 (DiGeorge综合征关键区)是典型miRNA生物发生的重要组成部分。越来越多的证据表明，miRNA参与肠上皮细胞发育、成体组织更新和疾病进展过程中的复杂调控网络。如miR-34a直接作用于Numb，影响ISCs细胞不对称分裂，抑制干细胞增殖。 miR-31通过调节Wnt和Hippo信号通路促进损伤后ISC增殖和上皮再生。此外，miR-802靶向Tmed9并调节肠上皮细胞增殖和Paneth细胞功能。然而，规范miRNA在肠道再生中的综合作用在很大程度上仍然未知，需要进一步探索。此外，miRNA在肠道疾病治疗方法中的临床应用需要广泛的研究。在对特定细胞的靶向治疗的追求中，人们正在不断发展以确保它们在所需靶细胞内的功能，同时最大限度地减少与免疫系统的相互作用。脂质纳米颗粒(LNPs)作为一类至关重要的药物传递系统，已被证明能够成功地将miRNA和siRNA传递到各种类型的细胞，包括肝细胞、肺和心血管内皮细胞、骨髓、脾内皮细胞和肺上皮细胞。例如，在小鼠急性结肠炎模型中口服LNPs-IL-22 mRNA可显著增强结肠黏膜IL-22蛋白表达，从而促进恢复过程。然而，LNPs- miRNA对肠道再生的影响尚不清楚。

图1

要点1：A.小鼠暴露在非致死剂量的9 Gy x射线照射下，已知会诱导增殖的隐窝上皮细胞损伤，并在辐射后第2、4和6天评估隐窝再生。B-C.肠上皮Dgcr8 KO小鼠表现出明显的体重减轻，并在一周内死亡，而对照组小鼠恢复迅速并存活。D.在对照组小鼠中，只有少数隐窝在放疗后2-4天出现萎缩，并迅速从损伤中恢复。E-F.相比之下，dgcr8缺失的肠上皮几乎所有隐窝在照射后立即缩小，绒毛在照射后第4天缩短。使用ISC标记Olfm4的IF分析显示，在放疗后第2天，dgcr8缺陷小鼠的ISC丢失。Ki67标记的细胞增殖在KO小鼠损伤后同样受损。G.此外，dgcr8缺陷小鼠上皮中CD45+免疫细胞的浸润水平增加，表明肠道通透性增加。H.此外，在Dgcr8 KO小鼠的上皮中观察到促炎NF-κB信号的过度激活。这些发现强调了DGCR8在损伤后隐窝再生中的重要功能。

图2

要点2：A.进一步验证DGCR8在肠道再生中的作用，采用另一种损伤模型，使用5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导增殖上皮细胞的损失。B-C.给药5- FU导致Dgcr8缺陷小鼠体重明显减轻，所有Dgcr8缺陷小鼠在损伤后5天内死亡。D.肠上皮苏木精和伊红(H&E)染色显示Dgcr8消融导致隐窝变小，绒毛萎缩。E.IF染色显示，dgcr8缺陷小鼠损伤后不久，Olfm4+ ISCs丢失，而WT小鼠的ISCs最初减少，但很快恢复。F.同样，Dgcr8缺陷小鼠的隐窝中ki67阳性增殖细胞在损伤后不久就丢失，而WT小鼠的隐窝中TA细胞在5天内几乎完全恢复。G-I.此外，5-FU处理导致Dgcr8缺陷小鼠的CD45+免疫细胞向肠腔的浸润增加，并伴有促炎细胞因子IFNγ和pNF-κB水平升高。这些表型与在辐照小鼠中观察到的表型非常相似，进一步证明DGCR8对肠上皮再生至关重要。

图3

要点3：A-B.与来自Dgcr8缺陷上皮的隐窝存活率较差(图3A)。同样，用4-羟基他莫昔芬(4-OHT)处理源自Villin-creERT2、Lgr5-EGFP-IRES-creERT2、Dgcr8loxP/loxP小鼠的类器官，导致出芽减少，细胞死亡增加。C.接下来，对WT和Dgcr8 KO类器官进行了大量RNA测序，以揭示Dgcr8的调控机制。在Dgcr8诱导缺失后，ISC标记基因Lgr5、Olfm4、Ascl2和Slc12a2的表达显著下调。相反，几种pri- miRNA，包括Mir17hg、Lncppara和Lncpint，在缺乏Dgcr8的类器官中上调。D-G.基因集富集分析(GSEA)表明，Dgcr8缺失降低了ISC和增殖特征基因的表达，与ISC和增殖标记物的下调一致。流式细胞术分析证实，由于Dgcr8缺乏，肠道类器官中Lgr5-GFPhigh的ISCs数量减少。H.为了进一步了解DGCR8如何调节ISCs，从WT和DGCR8 KO类器官中筛选了Lgr5-GFPhigh ISCs，并进行了大量RNA测序分析。同样，在Dgcr8缺失的ISCs中，Mir17hg、Lncppara和Lncpint等pri-miRNA表达上调，表明由于Dgcr8缺失，pri-miRNA加工和随后的miRNA生物发生受损。I.有趣的是，Cdkn1a(一种与增殖抑制相关的基因)和Atg9b(一种与自噬相关的基因)也在Dgcr8缺失的ISCs中上调。GSEA分析显示，TNFα-NFκB和p53通路是上调基因中排名靠前的通路。J.缺乏dgcr8的类器官中p53通路活性的增加可以解释Lgr5+ ISCs数量的减少和细胞增殖的降低。一致地，p53靶基因，包括Fas、Cdkn1a、Tp53inp1和Atg9b，在Dgcr8 KO类器官中显著上调。K.此外，缺乏Dgcr8的类器官中p53和p21的蛋白水平升高。这些发现表明，类器官中Dgcr8缺乏导致ISCs数量减少，细胞增殖减少，p53通路激活。

图4

要点4：A.为了确认p53是否在体内也被激活，5-FU给药24小时后从WT和Dgcr8缺陷小鼠中分离隐窝，并进行了大量RNA测序。结果显示，在Dgcr8缺失的隐窝中，pri-miRNAs Mir17hg、Lncppara和Lncpint上调，而干细胞标记物Olfm4下调。B.差异表达基因(DEGs)的基因本体(GO)富集分析表明，在与急性炎症反应、细胞凋亡和上皮细胞增殖负调控相关的通路中，上调基因显著富集。C.相反，发现下调基因参与DNA复制、双链断裂修复和细胞周期相变。D.使用Hallmark基因集进行GSEA分析显示，下调基因在E2F靶点、MYC靶点和G2M检查点通路中富集，这些靶点与细胞周期进展和细胞增殖有关。这些发现与观察到的Dgcr8缺陷上皮隐窝中增殖标志物Ki67水平的下降一致。E-G.与在急性损伤早期，ISC和增殖特征在下调基因中富集。重要的是，上皮miRNA的缺失与损伤相关特征的富集有关，这与体内损伤时Dgcr8缺陷上皮的表型相似。同时，Dgcr8缺失小鼠的隐窝响应5-FU, p53通路和凋亡被激活。H.免疫印迹证实Dgcr8缺陷上皮中p53和p21蛋白水平升高。这些观察结果促使进一步研究p53通路在调节ISC增殖和上皮再生中的作用。I.用MDM2抑制剂Nutlin3a治疗肠道类器官，可以稳定p53蛋白，增加其直接靶点Cdkn1a mRNA的表达，减弱ISC和细胞增殖相关基因的表达，以剂量依赖的方式减少出芽和增加细胞死亡。这些发现支持p53通路参与ISC增殖和上皮再生的调控。

图5

要点5：A-B.由于p53通路的活性与肠道再生能力呈负相关，因此研究了抑制p53通路对肠道再生的影响。用p53蛋白抑制剂聚氟乙烯酯-α氢溴化物(PFTα)处理Dgcr8缺失的类器官，可以挽救与ISCs和增殖相关基因的下调，增加出芽数量，提高类器官存活率。C-D.此外，PFTα治疗使60%的5-FU处理的Dgcr8 KO小鼠免于死亡。E-F.组织组织学检查显示，PFTα阻止隐窝丢失，并有效促进肠损伤后的再生，这与Olfm4显示的ISCs快速修复一致。G.此外，观察到PFTα可以恢复dgcr8缺陷上皮中的TA细胞。这些发现表明，与Dgcr8缺乏相关的肠道再生受损可以通过抑制p53途径有效地挽救。H.为了研究受损人类肠上皮中p53通路的激活，分析了健康个体和活动性溃疡性结肠炎(UC)患者的公开结肠组织数据集。分析显示，UC患者结肠组织中p53通路和凋亡被激活。此外，抗增殖和促凋亡基因TP53INP1的mRNA水平与活性UC组织中促炎细胞因子IL -1β和IL-6的表达呈正相关。这为p53通路的过度激活与结肠炎的发病机制有关提供了证据。

图6

要点6：A.为了确定Dgcr8缺陷上皮和类器官中导致ISCs缺失和p53通路激活的miRNA，从肠道类器官中分离出Lgr5-GFPhigh的ISCs，并进行小RNA测序。B.在绘制的miRNA中，只有几十个被发现在ISCs中高表达。当采用具有成本效益的Dgcr8独立稳定miRNA表达(DISME)策略将ISCs的优势miRNA重新引入到Villin-creERT2;Dgcr8loxP/loxP肠道类器官时，Dgcr8缺陷类器官的生长和存活得以挽救。C.在缺乏Dgcr8的情况下，反复传代这些类器官，富集了生长和存活所需的miRNA。对类器官中miRNA功能的汇总筛选发现了几种miRNA，包括miR-31-5p、miR-200b-3p、miR-200c-3p、miR-26a-5p和miR-429-3p，它们在存活的Dgcr8缺陷类器官中显著富集。在这些miRNA中，已知miR-31通过调节Wnt和Hippo通路的活性来驱动ISC增殖并促进损伤后上皮再生。D.GSEA分析进一步表明，miR-200家族的潜在靶向基因在Dgcr8缺失的类器官中显著富集。E.此外，转染化学修饰的miR-200b-3p激动剂(agomiR-200b)促进了类器官的出芽过程，而转染miR-200b-3p拮抗剂(antagomiR-200b)抑制了出芽过程并降低了类器官的存活。F.有趣的是，在Trp53和Cdkn1a miRNA的3 '-URT上发现了miR-200b-3p的潜在结合位点。G-J.双荧光素酶测定证实miR-200b-3p可以结合这些潜在位点并抑制荧光素酶蛋白的翻译。转染agomiR-200b降低了Dgcr8缺陷类器官中p53和p21蛋白水平，而转染antagomiR-200b则增加了p53和p21蛋白水平。在多个数据集中，在UC患者的结肠组织中观察到5个miR-200家族成员下调。

图7

要点7：A.通过转染LNPs-miR-NC-Cy3的人结肠癌细胞系(Caco-2)的荧光成像，可以通过LNPs有效地将miRNAs传递到细胞中。B-D.接下来，用Cy3标记的LNPs-miR-NC灌胃小鼠，然后安乐死以收集肠上皮样本。观察到LNPs成功地将miRNAs传递到肠上皮细胞，并且Cy3标记的LNPs-miR-NC主要在胃肠道中检测到。E-G.然后，研究了通过LNPs递送miR-200是否能够以剂量依赖的方式减轻辐照引起的Dgcr8缺陷小鼠肠上皮损伤后的表型变化。 LNPs-miR-200降低了上皮损伤程度，并使Dgcr8 KO小鼠免于死亡，这可以通过增加总存活率和以剂量依赖性方式减少受损隐窝数量来证明。H-I.使用LNPs-miR-200观察到ISCs的有效修复，如Olfm4的表达所示。同样，LNPs-miR-200也能恢复Dgcr8缺陷隐窝内的TA细胞。LNPs-miR-200的保护作用也在给予5-FU的Dgcr8 KO小鼠中得到验证。这些发现强烈表明，通过脂质纳米颗粒递送miR-200有可能促进辐照或5-FU处理小鼠的肠道再生。

图8

要点8：显示了携带miR-200的脂质纳米颗粒在促进小鼠急性损伤后肠道再生中的作用。在Dgcr8缺失的肠上皮细胞中，由于Dgcr8缺失导致miR-200家族的缺失，破坏了Trp53和Cdkn1a mRNA翻译的精确调控。因此，p53通路的升高阻碍了ISCs的增殖并阻碍了上皮细胞的再生。然而，通过脂质纳米颗粒递送miR-200可以挽救小鼠的肠道再生。

本文小结

综上所述，研究强调了上皮miRNA通过DGCR8/miR-200/p53轴在急性损伤后调节ISC增殖和促进肠道再生中的作用。此外，证明p53通路的衰减减轻了ISCs的抑制和上皮再生中观察到的缺陷。重要的是，携带miR-200的LNPs促进肠道再生。我们的研究强调DGCR8/miR-200/p53轴在控制肠道再生中的关键功能，并暗示使用miR-200负载LNPs作为活动性UC患者的一种有希望的治疗方法，特别是那些miR-200家族水平降低的患者。

参考文献： Wei X, Yu S, Zhang T, et al. MicroRNA-200 Loaded Lipid Nanoparticles Promote Intestinal Epithelium Regeneration in Canonical MicroRNA-Deficient Mice[J]. ACS nano, 2023.

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37939210/