IF 64.5 Cell │溶酶体快速响应细胞营养状态的新机制

IF 64.5 Cell │溶酶体快速响应细胞营养状态的新机制

前言

2023年10月25日，德国Leibniz-Forschungsinstitut fur Molekulare Pharmakologie (FMP)的Volker Haucke领导的研究团队在Cell上发表了题为“Nutrient-regulated control of lysosome function by signaling lipid conversion”的研究论文，研究揭示溶酶体上的PI(3)P和PI(4)P的水平会随着营养状态的变化而发生改变，进而调控溶酶体的形态与功能以及mTOR的激活。

背景介绍

溶酶体是真核细胞内一种具有单层膜结构的细胞器，其主要功能是降解各类生物大分子和一些受损的细胞器。事实上，溶酶体的功能绝不仅限于作为“垃圾处理中心”，越来越多的研究证据表明溶酶体可能也是细胞的代谢中枢，并在营养信号的感知和传递过程中发挥关键作用。一个很好的例子就是mTOR的激活，在营养充足的条件下，mTOR被招募至溶酶体表面并促进合成代谢；当营养不足时，mTOR会从溶酶体上解离下来，细胞的合成代谢被抑制而分解代谢增强。由于溶酶体控制细胞在合成代谢与分解代谢之间的转换，因此可以预见的是，溶酶体的功能一定会受到营养状态的精确调控。然而，尽管有研究显示转录调控因子TFEB（其转录活性会受到mTOR的调控）会在较长时间的饥饿处理下上调溶酶体基因的表达，但是溶酶体如何快速响应细胞内营养状态的变化目前仍不清楚。

图文解析

图1

要点1：A.研究人员发现通过荧光探针MagicRed(即cathepsin L蛋白酶活性)和SiR-溶酶体(即cathepsin D蛋白酶活性)监测的U2OS细胞的溶酶体蛋白水解活性在饥饿的反应中显著增加。B-C.在HeLa和U2OS细胞中，LAMP1标记的溶酶体聚集在核周，并且大部分是不运动的。D.在饥饿细胞的核周区域聚集了大的电子致密的、可能降解的溶酶体。E.在摄食细胞中，VSV-Gts从高尔基复合体高效地输出到细胞表面，而在饥饿细胞中，VSV-Gts主要滞留在核周高尔基体区域。F-G.饥饿诱导了几分钟内高尔基体PI(4)P的耗竭和相应的溶酶体PI(4)P的增加。H.因此，饥饿可以拮抗地控制溶酶体蛋白水解和蛋白分泌。

图2

要点2：A-D.饥饿可以通过诱导基因表达驱动溶酶体蛋白的重新合成来促进溶酶体蛋白水解。为了验证这一点，研究人员通过定量分析从喂食或饥饿的U2OS细胞中分离的溶酶体的蛋白质含量来确定可能的饥饿诱导的溶酶体蛋白质组的变化。尽管营养饥饿导致溶酶体形态和蛋白水解活性存在差异，但研究人员发现从喂食细胞和饥饿细胞分离的溶酶体中蛋白酶水平(例如组织蛋白酶)没有显著差异。一致地，饥饿诱导的组织蛋白酶L活性的增加与从头蛋白合成无关，主要溶酶体膜蛋白的总水平不受饥饿的影响。因此，短期(2-4小时)饥饿诱导的溶酶体功能和形态重塑不是由溶酶体酶或整个溶酶体的重新合成介导的。相反，它可能是由溶酶体通过调节因子(如磷酸肌醇代谢酶)的重塑引起的。E.通过自动图像分析监测了siRNA转染的U2OS细胞在pH6.5缓冲介质(即诱导溶酶体分散的条件)中的溶酶体位置。F.该分析确定了PI(4)P特异性4-磷酸酶Sac150作为溶酶体定位的有效调节剂。G.在U2OS细胞中，Sac1的缺失使溶酶体的运动性降低，并导致其在核周聚集，类似于Arl8b的缺失。H.这种表型通过在去除内源性Sac1的细胞中重新表达siRNA抗性的Sac1来挽救。I-J.Sac1敲除的细胞显示出溶酶体PI(4)P水平的显著增加和溶酶体蛋白酶活性的升高。K.对摄食Sac1敲低的细胞进行超微结构分析，发现扩大的电子致密的多层溶酶体堆积。L-M.这些溶酶体通常对积累在Sac1缺失细胞中的自噬体标记物LC3和自噬标志物呈免疫阳性。此外，研究人员观察到，在摄食细胞中定位于内质网(ER)的Sac1，在饥饿的刺激下，部分地重新定位到高尔基复合体上。

图3

要点3：A.这些数据表明Sac1是溶酶体功能的主要调节剂，可能是作为PI(4)P的酶汇，通过氧化固醇结合蛋白相关蛋白(ORP)家族蛋白(例如,OSBP和/或ORP4)在膜接触位点转移到内质网。B-D.OSW-1处理增加了溶酶体PI(4)P水平，导致扩大的电子致密的多层溶酶体的积累，并提高了溶酶体蛋白酶活性。E.定量脂质组学分析证实了PI-单磷酸(即PI(4)P)的积累，并且从OSW-1处理的细胞中分离出的溶酶体中胆固醇显著减少，但没有其他大块脂质。F-G.敲除ORP4后，OSW-1的溶酶体PI(4)P和溶酶体蛋白酶活性显著升高。H.与之一致的是，饥饿增加了内源性ORP4向溶酶体的募集。I.营养饥饿强烈诱导基因组工程细胞中内源mScarlet-PI4K2A向溶酶体募集，但不向高尔基体募集。J.利用与APEX2融合的溶酶体膜蛋白TMEM19256作为报告基因，通过邻近生物素化也观察到饥饿诱导的内源性PI4K2A的富集。K.敲低PI4K2A降低了溶酶体PI(4)P水平，这一表型随着PI4K3B的同时抑制而轻度加剧。L.在PI4K2A敲除(KO)细胞中溶酶体PI(4)P减少，从这些细胞中分离出的溶酶体通过定量脂质组学测定PI-单磷酸耗竭。M.在PI4K2A KO细胞中异位表达组成型靶向溶酶体的PI4KA嵌合体也恢复了溶酶体PI(4)P的合成，并拯救了溶酶体分散体。N-O.Sac1缺失引起的溶酶体PI(4)P水平升高和溶酶体核周聚集通过伴随PI4K2A的缺失得以挽救。P.在Sac1敲低的细胞中，PI4K2A的缺失也恢复了正常的溶酶体蛋白酶活性。

图4

要点4：A研究人员对稳定表达TMEM192-APEX2的U2OS细胞在对照条件下和OSW-1处理后，即溶酶体PI(4)P积累条件下的溶酶体表面蛋白质组进行了邻近生物素化定量分析。B.GO term分析发现，参与脂质代谢和转移的蛋白，如已知与PI(4)P结合的ORP家族蛋白，在OSW-1处理的细胞中高度富集在溶酶体上。参与自噬的蛋白和参与v-ATPase的蛋白也有积累。C.研究人员使用SidK作为报告基因证实了OSW-1处理的细胞中溶酶体v1-ATPase关联的增加。D.此外，Sid K与含PI(4)P的溶酶体共定位。E.肌管素家族PI(3)P3-磷酸酶如MTMR3，MTMR9和MTMR14富集在OSW-1处理的细胞的溶酶体上。H.在PI4K2A KO细胞中，雷帕霉素诱导的PI4KA募集到含有TMEM192的溶酶体中引起溶酶体PI(4)P的急性升高，导致KIF16Btail的快速解离。

图5

要点5：A.营养饥饿不能诱导KIF16Btail从PI4K2A KO溶酶体中解离。B-C.PI4K2A KO细胞也没有发生饥饿诱导的核周聚集，并且在溶酶体蛋白酶活性的诱导方面受损。D.研究人员在细胞中表达了一种无催化活性的MTMR14，并发现在饥饿条件下，MTMR14可以有效地募集到LysoTracker标记的溶酶体中，而在PI4K2A KO细胞中则没有。E-F.敲低MTMR14可以阻止饥饿诱导的溶酶体PI(3)P的耗竭和溶酶体蛋白酶活性的降低。G.最后，在Sac1敲低的细胞中，MTMR14的缺失部分恢复了缺陷的溶酶体定位，表明PI(3)P和PI(4)P作为溶酶体动力学的拮抗调节因子。

图6

要点6：A.为了直接观察PI(3)P和PI(4)P标记的溶酶体在形态和功能上的差异，研究人员开发了一种通过聚焦离子束扫描电子显微镜(FIB-SEM)的多色活体相关光和电子显微镜(live-CLEM)的工作流程。B.Live-CLEM显示核周静态溶酶体包含相对较大的细胞器(直径0.3~1μm)，其管腔内常含有电子致密物质和层状内膜系统，其特征通常与降解性溶酶体相关。C-D.静态溶酶体被Lyso Tracker明亮标记，具有较高的蛋白酶活性，在PI(4)P中高度富集，不含PI(3)P。E.进一步的live-CLEM分析表明，PI(4)P标记了大的电子致密的降解溶酶体区室，类似于静态溶酶体和饥饿细胞中的电子致密溶酶体。F-J.这些细胞器与周围运动性溶酶体显著不同，后者的大小显著较小，并且在电子致密物质和多层膜的存在方面具有更大的异质性。

图7

要点7：A.研究人员推测，以PI(3)P和PI(4)P标记的溶酶体的形态和分子二分法可能是溶酶体在介导合成代谢生长信号和大分子分解代谢转换的双重拮抗功能的基础。B-D.该模型的一个预测是，溶酶体PI(4)P升高，即降解溶酶体积累的条件，应该抑制mTORC1信号介导的溶酶体合成代谢功能。研究人员通过邻近标记蛋白质组学或免疫印迹分析OSW-1对溶酶体表面蛋白质组的影响来测试这一预测。研究人员发现在溶酶体PI(4)P升高的条件下，mTORC1的核心亚基从溶酶体表面被耗竭。E.由于Sac1或ORP4的缺失，溶酶体PI(4)P的升高抑制了Refed细胞中的mTORC1信号。相反，PI4K2A KO细胞中磷酸化的mTORC1底物包括pS6K，p4E-BP1，和pTFEB的水平在重喂食过程中升高。F-G.PI4K2A的缺失还导致饥饿诱导的mTOR从溶酶体中解离的动力学延迟和mTORC1信号的关闭。H-I.在PI(3)P磷酸酶MTMR14缺失的情况下，溶酶体PI(3)P的积累促进了mTORC1信号，并导致饥饿细胞中mTOR在溶酶体上的部分滞留。J.在共敲低MTMR14的细胞中，溶酶体PI(3)P的升高恢复了Sac1敲低细胞中正常的mTORC1信号。K-L.S6K1的一个类似物敏感等位基因，能够特异性利用N6-(苄基)-ATP硫酯，促进PI4K2A的硫代磷酸化，表明PI4K2A是S6K1的直接底物。敲除S6K1，而不是S6K2，减弱了PI4K2A磷酸化的刺激，并模拟了雷帕霉素的作用。S6K1 KO细胞表现为溶酶体PI(4)P水平升高。

全文小结

综上所述，溶酶体的形态和功能由营养调节的信号脂质开关可逆控制，该开关触发聚集在细胞中心的外周运动mTOR复合物1（mTORC1）信号活性和静态mTORC1活性降解溶酶体之间的转换。饥饿引发的磷酸4-磷脂酰肌醇（PI(4)P）代谢酶的重新定位重塑溶酶体表面蛋白质组，以促进溶酶体蛋白水解和抑制mTORC1信号转导。同时，溶酶体磷脂酰肌醇3-磷酸（PI(3)P）被清除，它标志着细胞外周的运动信号活性溶酶体。对这种PI(3)P/PI(4)P脂质开关模型的干扰，会损害细胞对改变营养供应时的适应性反应。研究揭示了溶酶体磷酸肌醇代谢在响应细胞营养状态时重新连接细胞器膜动力学的一个关键功能。

参考文献：Ebner M, Puchkov D, López-Ortega O,   et al.Nutrient-regulated control of lysosome function by signaling lipid conversion. Cell. 2023 Oct 18:S0092-8674(23)01081-4. doi: 10.1016/j.cell.2023.09.027. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.09.027