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If 37.8 Circulation│线粒体蛋白翻译减少促进心肌细胞增殖和心脏再生

If 37.8 Circulation│线粒体蛋白翻译减少促进心肌细胞增殖和心脏再生


前言

2023年10月31日,浙江大学陈静海及南佛罗里达大学王大之教授团队在Circulation杂志上发表了题为“Reduced Mitochondrial Protein Translation Promotes Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration”的研究论文,该研究表明减少线粒体蛋白翻译能够促进心肌细胞增殖和心脏再生。



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背景介绍

线粒体在正常心脏功能中的重要性已得到充分认识,最近的研究表明,线粒体代谢的变化与某些形式的心脏病有关。先前的研究表明,小干扰RNA(siRNA)敲低线粒体核糖体蛋白S5(MRPS5)可抑制线粒体翻译,从而导致有丝分裂核蛋白失衡。尽管目前对潜在疾病机制的了解取得了巨大进展,但心血管疾病仍然是工业化国家和发展中国家的主要死亡原因。





图文解析


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图1

要点1:A-B.研究人员构建了心脏特异性的Mrps5突变小鼠,发现心脏中Mrps5的缺失会导致线粒体缺陷,从而导致心力衰竭。出乎意料的是,研究人员发现心脏特异性Mrps5杂合子小鼠(Mrps5flox/+;Myh6-Cre,以下简称Mrps5cHET)的心脏显著大于对照(Mrps5flox/+)小鼠,而对照(Mrps5flox/+)小鼠和Myh6-Cre小鼠的心脏在形态和功能上没有差异。C.心脏质量/体质量(HW/BW)比值在P4至Mrps5cHET小鼠中较高P28/。D-E.组织切片和麦胚凝集素染色后定量显示,在P14、P21和P28,Mrps5cHET心脏中心肌细胞的大小明显较小。F.为了证实上述观察,更好地确定心肌细胞大小与成核之间的分布和相关性,研究人员分离了成年Mrps5cHET和对照小鼠的心肌细胞。研究人员发现在Mrps5cHET心脏中单核增加,双核心肌细胞减少,多核心肌细胞比例无明显差异。G-J.这一观察结果促使研究人员考察是否存在心肌细胞增殖增加的现象Mrps5cHET心脏。研究人员对Mrps5cHET心脏进行了分析出生后P4~2个月,用增殖标记物进行免疫染色;研究人员发现,Ki67、磷酸化组蛋白H3(pH3)和AuroraB阳性的心肌细胞在Mrps5cHET心脏中的数量从P4到P5逐渐增加P28。K-L.到生后2个月,心肌细胞增殖的增加似乎逐渐减弱。为了确定成年后Mrps5的减少是否也能促进心肌细胞增殖,研究人员接下来构建了他莫昔芬(TAM)诱导的心脏特异性Mrps5杂合子小鼠(Mrps5iHET),并将其与谱系追踪系统(MADM)小鼠品系(Mrps5iHET;MADM)进行交配,以检测心肌细胞的分裂。M.成年人Mrps5iHET的评估;MADM小鼠显示出更多单标记的绿色或红色心肌细胞,表明Mrps5减少导致新的心肌细胞形成。这些发现揭示了减少的线粒体翻译促进了出生后阶段和年轻成年期的心肌细胞增殖,而不损害心脏功能。






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图2

要点2:A.将TAM注射到8~10周龄的Mrps5iHET和对照小鼠体内,然后进行手术诱导MI;注射5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)检测细胞增殖。B-C.连续的超声心动图分析显示,MI后的Mrps5iHET小鼠比对照小鼠保留了更好的心脏功能;通过测定这些动物较高的射血分数和短轴缩短率,以及收缩期和舒张期左心室内径和体积的减小,证实了这一点。D-E.在MI后,Mrps5iHET小鼠的梗死面积明显减小。F-G.研究人员检测了MI后7天的心肌细胞增殖,并检测到Mrps5iHET小鼠中pH3和AuroraB阳性心肌细胞的大量增加。H-I.MI后3周和9周,成年Mrps5iHET心脏心肌细胞EdU掺入增加,进一步支持了这一观察结果。J.对心脏切片进行染色发现,Mrps5iHET心脏中心肌细胞体积较小,这也与MI后心肌细胞增殖相一致。K.通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记(TUNEL)染色检测心肌细胞死亡,发现MI后3周Mrps5iHET心脏中TUNEL阳性的心肌细胞显著减少。L.研究人员在Mrps5iHET中发现了更多单标记的绿色或红色心肌细胞;MADM心脏,表明Mrps5减少促进MI后心脏再生。总之,这些数据表明,成年小鼠中Mrps5和线粒体翻译的减少保护心脏免受MI相关的损伤,可能是由于心肌细胞增殖的激活。







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图3

要点3:A-C.磷酸化的eIF2α(p-eIF2α)与应激反应中为了能量守恒而抑制全局翻译有关。因此,研究人员利用这些数据研究了线粒体翻译减少是否触发了Mrps5cHET小鼠心脏中的线粒体应激。研究人员观察到在Mrps5cHET心脏中,GCN2和PERK的蛋白水平都显著增加。如预期的那样,p-eIF2α有显著增加,但总eIF2α蛋白没有显著增加。D.对P4代Mrps5cHET心脏线粒体应激反应相关基因的表达水平进行分析,发现Atf4 mRNA水平显著升高。E.在Mrps5iHET梗死心脏中也观察到类似的表型,包括Atf4的上调;研究人员发现在MI后7天,Mrps5iHET心脏中其他线粒体应激反应水平增加。F.接下来,研究人员检测了线粒体翻译减少是否影响了Mrps5cHET心脏中线粒体的结构和功能。透射电镜检查未发现Mrps5cHET小鼠和对照小鼠心脏线粒体形态的差异。G-I.此外,与对照组相比,Mrps5cHET小鼠的相对氧物种水平和ATP含量均没有变化。J.研究人员还测定了TCA循环、电子传递链和糖酵解相关基因的表达水平,发现Mrps5cHET与对照心脏之间没有显著差异。K.为了在体外建立代谢状态,研究人员使用siRNA在乳鼠心肌细胞中敲低Mrps5。敲低Mrps5后,耗氧速率略有降低,胞外酸化速率无明显变化。这些数据表明,尽管在Mrps5杂合子小鼠中线粒体翻译减少,但正常的线粒体功能是维持的,并且与ATF4信号的激活相关。





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图4

要点4:A.为了确定ATF4是否在成年Mrps5杂合子小鼠的心肌细胞增殖调控中发挥作用,研究人员利用TAM诱导系统构建了可诱导的Mrps5和Atf4双杂合子小鼠(idHET)及其阴性对照(idCtrl).B-C.在Mrps5iHET小鼠心脏大小和HW/BW比值增加的同时,这种增加在idHET小鼠心脏中被抑制。D.心肌细胞大小在Mrps5iHET心脏中减小,与研究人员之前的数据一致;然而,idHET小鼠的心肌细胞大小与idCtrl小鼠相当。E-F.EdU掺入实验显示,注射TAM后2周和4周,Mrps5iHET组心肌细胞增殖增加,而idHET组心肌细胞增殖与idCtrl组无明显差异。G-H.通过pH3和AuroraB染色进一步支持了这些发现,在Mrps5iHET心脏中进行有丝分裂和胞质分裂的心肌细胞数量增加,而在idHET心脏中则急剧减少。这些数据为ATF4参与Mrps5杂合子小鼠出生后和成年期心肌细胞增殖的调控提供了证据。





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图5

要点5:A.为了证实在Mrps5杂合子小鼠中观察到的增强的心脏再生是通过激活ATF4信号介导的,研究人员在成年iCtrl,Mrps5iHET,idCtrl和idHET小鼠中进行了MI。B-C.4组大鼠MI后1周心功能比较差异无统计学意义;然而,在连续时间点的超声心动图评估中,Mrps5iHET小鼠(MI后3周和5周)有显著改善,但在其他3组,包括idHET小鼠中没有观察到。D.研究人员发现,MI后5周,idHET心脏不再表现出任何减少梗死面积的能力。E.研究人员验证了Mrps5的表达水平在iHET和idHET组中降低,Atf4的表达仅在iHET组中增强。研究人员还发现细胞增殖标志基因(如,Mki67、Aurkb和Top2a)在iHET心脏中表达上调;然而,在idHET心脏中没有观察到明显的变化。F-G.数据显示,在Mrps5iHET心脏中,EdU阳性的心肌细胞比例显著增加,而在idHET心脏中,EdU阳性的心肌细胞比例显著减少。




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图6

要点6:A.为了深入了解线粒体翻译减少引发心肌细胞增殖的潜在分子机制,研究人员对P4代Mrps5cHET心脏进行了RNA测序,并与Ctrl心脏进行了比较。B-C.基因本体富集分析和基因集富集分析(GSEA)均显示上调的通路大多与细胞增殖和分裂(例如,细胞分裂,染色质分离,核DNA复制和有丝分裂胞质分裂途径)有关。D.利用实时定量聚合酶链式反应实验,研究人员验证了P4和P28时Mrps5cHET心脏中细胞分裂相关基因的上调。E.研究人员鉴定了超过4,880个假定的ATF4结合峰,这些基因包括Knl1、Mki67、Top2a、Kif11和Incenp等已知对细胞分裂和增殖有重要作用的基因。F-G.通过ChIP-定量聚合酶链式反应实验,研究人员证实了ATF4与Knl1启动子的强结合,通过荧光素酶报告分析进一步验证了这种相互作用,其中强制过表达ATF4增加了Knl1启动子的活性。H.研究人员还发现Mrps5cHET小鼠心脏中KNL1蛋白水平升高,与ATF4蛋白水平升高相关。I.有趣的是,研究人员发现在Mrps5cHET心脏中显著上调的84个基因中,有21个(25%)与ATF4 Bio ChIP测序基因集重叠,表明ATF4与这21个基因的启动子/增强子结合激活它们的转录。J.对这21个基因进行GO分析发现,它们与细胞分裂、核分裂、染色体分离和染色质组织有关。K.对其余63个基因进行GO分析,发现核染色体分离基因在Mrps5cHET心脏中富集最显著。这些数据支持ATF4在Mrps5cHET心脏细胞分裂相关基因的转录调控中发挥作用。




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图7

要点7:A.为了确定Mrps5-ATF4信号是否参与了之前讨论的多西环素研究中观察到的心脏保护和心脏再生,研究人员用多西环素处理成年野生型小鼠,并进行MI手术诱导心脏损伤和再生。B-C.超声心动图显示,在MI后5周,多西环素治疗的小鼠表现出更好的心脏功能。D.这些结果进一步被观察到多西环素治疗的小鼠梗死面积减少所支持。E-G.研究人员确定多西环素处理的心脏在MI后心肌细胞增殖增加;通过EdU掺入、pH3和AuroraB染色测定,与对照组相比,多西环素注射小鼠的心肌细胞进行DNA复制、有丝分裂和胞质分裂的百分比增加。H.与之前的报道一致,研究人员发现多西环素处理激活了线粒体应激反应,表现为MI后1周p-eIF2α及其上游激酶GCN2和PERK的增加。正如预期的那样,研究人员发现在多西环素处理的心脏中,ATF4和Knl1的蛋白水平在MI后均增加;研究人员还观察到在多西环素处理的心脏中ANP的减少。综上所述,这些数据表明多西环素抑制线粒体翻译通过激活eIF2α-ATF4-Knl1信号通路促进心肌细胞增殖和心脏再生。



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图8

要点8:A.当Mrps5被抑制时,细胞分裂相关基因,包括Cenpf,Knl1,Gem和Mki67的表达增加,这与研究人员在小鼠心脏中观察到的结果一致。B-C.研究人员还发现,抑制Mrps5导致hiPSC-CMs中细胞增殖显著增加,表现为小干扰Mrps5样本中EdU掺入和pH3染色增加。D-E.与之前的实验一致,多西环素处理也促进了hiPSC-CMs中心肌细胞的增殖。这些数据表明,线粒体翻译的减少可以显著促进hiPSC-CMs中的细胞增殖。

全文小结

综上所述,这项研究表明,线粒体翻译抑制通过线粒体应激反应和综合应激反应激活的ATF4信号,促进小鼠和人类心肌细胞增殖和心脏再生,进一步强调了线粒体和核通讯在心肌细胞增殖和心脏再生过程中应对线粒体应激的重要作用。



参考文献:Gao, F., Liang, T., Lu, Y. W., Pu, L., Fu, X., Dong, X., Hong, T., Zhang, F., Liu, N., Zhou, Y., Wang, H., Liang, P., Guo, Y., Yu, H., Zhu, W., Hu, X., Chen, H., Zhou, B., Pu, W. T., Mably, J. D., … Chen, J. (2023). Reduced Mitochondrial Protein Translation Promotes Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Circulation, 10.1161/CIRCULATIONAHA.122.061192. Advance online publication. https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.122.061192


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