IF 16 Molecular Cell丨乳酸可激活线粒体电子传递链，而不受新陈代谢的影响IF 16 Molecular Cell丨乳酸可激活线粒体电子传递链，而不受新陈代谢的影响 前言 2023年10月24日，Memorial Sloan Kettering肿瘤中心Craig B. Thompson团队等人在Molecular Cell杂志上在线发表了题为“Lactate activates the mitochondrial electron transport chain independently of its metabolism”的研究性论文。研究证明了未代谢的D-乳酸盐可选择性地诱导线粒体氧化磷酸化，以ATP依赖性方式可逆地抑制癌细胞系和增殖原代细胞中的有氧糖酵解，并使细胞在呼吸依赖性生物能底物上生长。在原代T细胞中，D-乳酸盐能增强细胞增殖和效应器功能。这些发现共同表明，乳酸盐是线粒体氧化磷酸化抑制葡萄糖发酵能力的关键调节因子。
背景 长期以来，乳酸盐一直被认为是一种细胞废物。然而，研究人员发现，随着细胞外乳酸盐的积累，它也会进入线粒体基质并刺激线粒体电子传递链（ETC）的活性。线粒体ATP合成的增加抑制了糖酵解，增加了丙酮酸和/或替代呼吸底物的利用。乳酸盐增加氧化磷酸化的能力并不取决于其代谢。L型和D型乳酸盐都能有效增强ETC活性并抑制糖酵解。
图1 要点1：A.乳酸在限制葡萄糖的情况下支持细胞生长并抑制糖酵解首先研究乳酸作为碳源的功能。当HepG2细胞在含10mM葡萄糖的完整组织培养基中培养时，细胞持续增殖，一周内增殖超过10倍。然而，当将培养基中的葡萄糖替换为等量的L-乳酸(20mM)形式的还原性碳时，细胞无法维持其活力和增殖。B.接下来，降低葡萄糖的水平，直到它达到生长的极限在限制葡萄糖(1mM葡萄糖)的情况下，添加20mM L-乳酸显著恢复细胞增殖，同时意外地减少了葡萄糖消耗。C.为了研究糖酵解抑制的可能性是由于ldl介导的乳酸-丙酮酸转化降低了胞质内NAD+/NADH比值，研究人员询问了L-alpha-hydroxybutyrate(AHB)，一种LDH底物和L-乳酸的胞质氧化还原当量，是否具有类似的作用。D-E.通过细胞葡萄糖消耗和糖酵解质子外排率(glycoPER)测量，L-AHB处理没有导致糖酵解抑制。F.相反，通过表达LbNOX(一种短乳杆菌NADH氧化酶，可直接将胞质NADH转化为NAD+)来增加胞质内NAD+/NADH比值，并不会抑制乳酸对葡萄糖代谢的影响。这些结果表明，仅调节胞质氧化还原不足以解释乳酸对糖酵解的抑制。G.乳酸刺激线粒体ATP的产生接下来，评估了乳酸对线粒体呼吸的影响。乳酸加入培养基后，细胞耗氧量(OCR)迅速增加。H.这些结果表明，乳酸刺激线粒体ATP偶联ETC活性，并促使研究人员研究增加线粒体ATP产生对乳酸抑制糖酵解能力的作用。在培养基中添加5nM的寡霉素就足以逆转乳酸介导的糖酵解抑制。
图2 要点2：A-B.乳酸可以以两种对映体形式存在，哺乳动物LDHA/B的代谢对L-乳酸或α-酮酸的(S)-对映体具有立体选择性。因此，研究人员想知道D-乳酸(不是LDHA/B的底物)是否有类似的作用。虽然已经克隆了一种有望将D-乳酸转化为丙酮酸的哺乳动物LDHD酶，但其表达具有组织选择性，主要在初级阶段表达肝细胞和不存在于大多数组织中。研究人员一致发现，通过RNA测序评估，细胞系中LDHD的表达极低，甚至无法检测到。为了测量细胞内LDHD酶活性，使用统一的13C标记的[U-13C]D-乳酸进行实验。在多个细胞系和未转化的细胞中未观察到丙酮酸或柠檬酸标记。因此，在研究中使用的细胞，LDHD的活性并不会促进丙酮酸或TCA循环中间体的产生。C.引人注目的是，尽管没有代谢为丙酮酸盐或柠檬酸盐，但D-乳酸添加到培养基中迅速增加了线粒体OCR和偶联ATP的产生。D-E.与此一致的是，添加D-乳酸增加了低糖环境下细胞的存活和增殖，抑制了细胞的葡萄糖消耗。总的来说，研究结果表明，乳酸的两种立体异构体都可以增加氧化磷酸化并抑制糖酵解，而这些作用与乳酸转化为丙酮酸或进入TCA循环无关。接下来，测试了D-乳酸逆转有氧糖酵解的能力。F.如图2B和2C所示，D-乳酸刺激氧气消耗和线粒体ATP产生，而不转化为丙酮酸或柠檬酸。当同时测量细胞外酸化速率(ECAR)时，发现D-乳酸模拟的耗氧量与细胞外酸化的减少相关。更重要的是，当用寡霉素抑制线粒体ATP产生时，通过ECAR的恢复测量，糖酵解同时恢复到对照细胞的水平。这些结果表明，D-乳酸可以通过刺激氧化磷酸化抑制葡萄糖发酵，并且有氧糖酵解(Warburg效应)是可逆的。
图3 要点3：A.使用[U-13C]葡萄糖和[3-13C]L-乳酸的同位素示踪来同时确定不同乳酸浓度下乳酸和葡萄糖碳的命运。B-C.该分析显示，即使在葡萄糖大量过剩的情况下，乳酸也是丙酮酸的主要细胞来源，并且乳酸对丙酮酸的贡献呈剂量依赖性增加。此外，进入TCA循环的丙酮酸通量随着乳酸浓度的增加呈剂量依赖性增加。这些结果促使研究人员研究乳酸对PDH复合物活性的影响，PDH复合物是丙酮酸进入TCA循环的限速步骤。PDH活性受E1α亚基上三个丝氨酸残基的抑制性磷酸化水平调控。D.PDHE1α磷酸化由PDH激酶(PDKs)和磷酸酶(pdp)的活性平衡，并受线粒体ETC活性和NAD+/NADH比值调节在完全培养基中生长的细胞具有显著的PDH E1α磷酸化，可被PDK抑制剂二氯乙酸(DCA)降低，后者直接激活PDH复合物。E-G.在培养基中添加L-乳酸导致PDH的剂量和时间依赖性激活，如E1α抑制磷酸化在多个丝氨酸残基和多个细胞系中的降低所示。H.与LDHD无关的机制一致，D-乳酸与L-乳酸在激活PDH和减少其在细胞中的磷酸化方面相当。这种能力在进化上是保守的。I.当用D-或L-乳酸处理时，果蝇S2细胞也表现出PDH E1α磷酸化抑制。为了证实乳酸诱导的PDH激活增加了碳进入TCA循环，J-K.首先测量了用D-乳酸或L-乳酸处理细胞后丙酮酸和柠檬酸的丰度。尽管D-乳酸不被代谢为丙酮酸盐或柠檬酸盐，但在高(25mM)或低(2.5mM)葡萄糖培养基中，与L-乳酸相似，D-乳酸显著提高了柠檬酸盐的总水平，而细胞总丙酮酸水平受到的影响最小。L-M.在添加2.5mM[U-13C]L-乳酸的完全培养基中生长的细胞中，D -乳酸的添加显著提高了[U-13C]L-乳酸的柠檬酸盐M+2标记率，尽管丙酮酸盐(M+3)的L-乳酸标记率略有降低。这些结果表明，独立于其代谢，乳酸刺激线粒体呼吸导致丙酮酸进入和氧化线粒体TCA循环的增加。
图4 要点4：A.使用已建立的细胞分离程序纯化的线粒体与呼吸底物在等渗缓冲液中孵育。B.与偶联线粒体的预期一样，ADP刺激ETC活性并降低PDH E1α磷酸化，而ATP的加入抑制ETC活性并增加抑制性PDH磷酸化。作为阳性对照，激酶抑制剂DCA导致PDH和支链酮酸脱氢酶(BCKDH)复合物的E1α亚基去磷酸化，这是一种密切相关的线粒体α-酮酸脱氢酶家族成员，已知也被DCA激活。相反，L-乳酸添加导致PDH E1α选择性去磷酸化，而不是BCKDH E1α。L-乳酸降低纯化线粒体中PDH磷酸化的能力大于丙酮酸。C.当在纯化的线粒体中检测乳酸活化PDH的立体特异性时，发现L-乳酸和D-乳酸抑制PDH E1α-磷酸化的能力相同，而不影响BCKDH E1α。D.乳酸直接进入线粒体基质，不依赖于MPC。乳酸刺激分离线粒体线粒体活性的能力促使对乳酸在线粒体基质内代谢和转运的研究研究人员首先在野生型线粒体中进行碳示踪，其中[U-13C]丙酮酸导致预期的TCA底物标记，当添加UK5099时，线粒体丙酮酸载体(MPC)抑制剂被取消。E-F.在纯化的野生型线粒体中添加[U-13C]L-乳酸不会导致柠檬酸盐或α-酮戊二酸(αKG)标记，这表明乳酸不能在纯化的线粒体中直接代谢。这些结果表明，像D-乳酸一样，L-乳酸激活纯化线粒体中PDH复合物的能力也独立于其代谢。接下来，研究人员在表达线粒体基质靶向LDHA(mitto-LDHA)的活性或非活性形式的分离线粒体中进行同位素示踪。与野生型线粒体相比，当向表达mito-LDHA的线粒体中添加[U-13C] L-乳酸时，观察到显著的柠檬酸盐和aKG M+2标记值得注意的是，与丙酮酸不同，柠檬酸盐和αKG的乳酸标记没有被UK5099降低，并且只发生在表达mito-LDHA的线粒体中，而不发生在H193A催化LDHA突变体中。G.在完整的细胞中也得到了类似的结果，在对照细胞中MPC1的缺失抑制了丙酮酸进入TCA循环。然而，在同样表达功能性mitoLDHA的细胞中，即使在没有MPC的情况下，L-乳酸也保留了标记TCA循环柠檬酸盐和αKG的能力。总的来说，这些结果表明乳酸可以进入线粒体基质，这与最近使用成像探针证明线粒体基质中存在乳酸一致此外，研究结果表明，乳酸的线粒体进入是直接的，而不是由于基质中的次级代谢，乳酸的进入与MPC无关。这些结果表明，乳酸刺激纯化线粒体的活性，而不被代谢为丙酮酸，直接进入线粒体基质，独立于MPC。
图5 要点5：A-B.如果乳酸对PDH复合物有直接的变构作用，那么这种作用应该与线粒体膜完整性无关。然而，当纯化的线粒体通过反复冷冻/解冻循环或温和的非离子洗涤剂渗透时，D-乳酸和L-乳酸抑制PDH E1α磷酸化的能力被取消。相比之下，PDK抑制剂DCA或PDP激活剂钙对PDH E1α磷酸化的影响在通透化的线粒体中保留。这些结果表明乳酸不太可能直接激活PDH复合物。接下来，考虑了乳酸首先刺激ETC活性并降低PDH磷酸化作为下游效应的可能性。C.氧作为细胞中主要的电子受体，在调节ETC活性和线粒体氧化还原中起着关键作用在低氧条件下(0.5%氧气)培养细胞过夜，乳酸降低PDH E1α磷酸化的能力被破坏。D.这种效应与Hif1α稳定无关，因为CoCl2治疗稳定了Hif1α但不影响乳酸诱导的PDH E1α去磷酸化。这些结果表明，乳酸降低PDH E1α磷酸化的能力依赖于氧可用性，而不是被Hif1α抑制。E.接下来，为了直接测试ETC的作用，转向Rho0细胞，它缺乏线粒体DNA，因此缺乏功能性的ETC.与野生型143B细胞相比，DCA保留了在ETC缺乏的Rho0细胞中去磷酸化PDH E1α的能力。然而，L-和D-乳酸去磷酸化PDH E1α的能力在Rho0细胞中丧失，这表明ETC在乳酸诱导的PDH激活中是必不可少的。F.线粒体ETC将NADH转化为NAD+，并且已知线粒体NAD+/NADH比值的增加可以激活PDH复合物与乳酸孵育分离的线粒体导致线粒体NAD+/NADH比值增加。G.与独立于线粒体丙酮酸进入激活ETC的能力相一致，即使在缺乏PDH复合物(PDH E2缺失)的线粒体中，乳酸也增加了NAD+/NADH比值。H.在PDH E1α或E2缺乏的细胞中，乳酸保持了增加线粒体OCR的能力，这表明ETC活性的增加与通过PDH复合物的碳进入无关，PDH激活是乳酸激活ETC的次要效应。
图6 要点6：A-D.发现在含有半乳糖的培养基中加入D-乳酸可以挽救细胞存活，并促进转化细胞和非转化细胞的细胞增殖。接下来，研究人员研究了D-乳酸对ETC功能受损细胞的影响。E-F.呼吸缺陷细胞增殖受损，需要补充的电子受体来促进生物合成和ATP的产生，通常以丙酮酸的形式存在，以存活和增殖。研究了D-乳酸对增加鱼藤酮(一种复合物I抑制剂)或抗霉素A(一种复合物III抑制剂)培养的细胞增殖的影响。虽然D-乳酸在鱼藤酮中提供了适度的生长优势，但当与抗霉素A一起处理时，它显著增强了细胞的增殖能力。G.丙酮酸通过LDH反应增加胞质内NAD+，从而支持呼吸缺陷细胞的代谢适应。正如预期的那样，具有与丙酮酸相反的胞质氧化还原作用的L-乳酸不能支持143B CytB增殖。然而，D-乳酸使143B CytB细胞在没有丙酮酸的情况下继续增殖，这与D-乳酸选择性增加ETC活性的作用一致，而不通过胞质乳酸脱氢酶代谢并影响胞质氧化还原。H.D-乳酸可以支持143B CytB细胞的增殖，但不能维持143B Rho0细胞的存活或增殖，提示D-乳酸促进存活和生长的能力需要一定的ETC活性。I.最后，D-乳酸对143B CytB细胞尿苷需求的影响与丙酮酸不同。补充丙酮酸可使143B CytB细胞存活，但除非培养基中含有补充尿苷，否则细胞无法增殖，尿苷的合成依赖于二氢羟酸脱氢酶(DHODH)通过Q循环到复合物III的功能电子转移。相反，D-乳酸在没有尿苷的情况下使143B CytB细胞适度增殖。这些数据表明，D-乳酸刺激ETC活性不仅增强了TCA循环提供的电子转移，还增强了线粒体基质外反应(如DHODH活性产生的反应)转移的电子。
图7 要点7：A.T细胞在含αCD3、αCD28和白细胞介素-2的完全培养液中扩增。D-乳酸的加入刺激了线粒体呼吸，增加了偶联ATP合成。B.D-乳酸也抑制T细胞的葡萄糖消耗。这些结果与研究人员在永生化细胞系中的观察结果一致，表明D-乳酸可以刺激线粒体氧化磷酸化，同时降低糖酵解的高速率在细胞免疫治疗的T细胞准备过程中，导致介质频繁变化。C.接下来，研究了D-乳酸是否可以在葡萄糖限制条件下增强T细胞功能，这在肿瘤中经常遇到。如前所述，当培养基中的葡萄糖浓度降低到1mm时，T细胞的进一步扩增和细胞因子生产的维持受到损害。在这些条件下，D-乳酸恢复T细胞增殖扩张。D.T细胞数量增加了8倍，干扰素-γ的表达显著增加，干扰素-γ是T细胞效应功能的标志。E.T细胞效应功能是一个高度依赖ATP/GTP的过程，研究结果表明D-乳酸增加线粒体ATP的产生。一致地，D-乳酸处理导致细胞蛋白质合成速率的增加，这表明D-乳酸刺激T细胞效应功能的机制基础是通过ATP依赖性的支持。 小结 综上所述，D-乳酸降低线粒体还原性应激的能力在其他与线粒体还原性应激相关的疾病的研究中也有重要的潜在应用，包括神经退行性疾病、心血管疾病和衰老。在减少线粒体还原性应激的同时刺激氧化磷酸化的能力为研究线粒体应激与各种疾病的关联提供了一种新的工具。总的来说，这些结果表明乳酸是细胞ATP产生的主要决定因素，也是氧化磷酸化抑制葡萄糖发酵能力的关键调节因子。 参考文献：Xin C、Charles P、Olivia J.et al.Lactate activates the mitochondrial electrontransport chain independently of its metabolism.Molecular Cell.October 24, 2023 https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.09.034 |
