​IF 16.6  Nature Communications│NatD通过阻止组蛋白H4丝氨酸磷酸化激活Slug表达促进肺癌进展

IF 16.6   Nature Communications│NatD通过阻止组蛋白H4丝氨酸磷酸化激活Slug表达促进肺癌进展

前言

2023年10月13日，南京大学赵权和魏继武教授研究团队在Nature Communications杂志上发表了题为“NatD promotes lung cancer progression by preventing histone H4 serine phosphorylation to activate Slug expression”的研究论文，揭示了在肺癌进展过程中，NatD是细胞侵袭的重要表观遗传调节剂。

背景介绍

N-α-乙酰基转移酶D(NatD)介导已知参与细胞生长的组蛋白H4的N-α末端乙酰化(Nt-乙酰化)。N-α-末端乙酰化(Nt-acetylation)是真核生物中最常见的蛋白质共价修饰之一，发生在人类80-90%的可溶性蛋白和酵母50-70%的可溶性蛋白中。这种修饰具有多种生物学作用，包括调节蛋白质降解、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质移位、膜附着、细胞凋亡和细胞代谢等。

图文解析

图1

要点1：a.实时荧光定量PCR分析显示，与癌旁正常组织样本相比，69%(20/29)的肺癌组织样本中NatD水平显著升高。b-c.研究人员发现，与正常肺组织相比，NatD在鳞癌和腺癌中均显著上调。d.值得注意的是，NatD表达与更高级别淋巴结状态相关。e.重要的是，Kaplan-Meier生存分析显示，NatD高表达的肺癌患者总生存期较短。

图2

要点2：a-b.为了确定NatD对细胞生长和运动能力的影响，研究人员使用含有不同靶向NatD mRNA的特异性shRNA的慢病毒载体构建了两个独立的、稳定敲低NatD的人肺癌H1299细胞系(NatD-KD1和NatD-KD2细胞)。由于shRNA KD2产生了更好的敲低效果，除非同时使用NatD-KD1和NatD-KD2细胞，否则只使用NatD-KD2细胞。实时荧光定量PCR结果显示，NatD-KD1和NatD-KD2细胞中NatD mRNA水平降低至Scr细胞中NatD mRNA水平的30%，Western blot结果显示NatD蛋白水平降低。c.以上结果表明，NatD对肺癌细胞的生长和存活没有影响。然而，在划痕实验中，NatD敲低的细胞迁移速度明显慢于Scr细胞。d.与之一致的是，延时细胞追踪分析动态证实了研究人员的观察，与Scr细胞相比，NatD敲低细胞的随机运动能力降低。e-f.此外，Transwell实验结果显示，与Scr细胞相比，NatD敲低细胞中肺癌细胞的迁移和侵袭能力显著降低。

图3

要点3：a.为了在体内模型中进一步研究NatD对肺癌细胞侵袭的影响，将荧光素酶标记的Scr或NatD敲低的A549细胞通过尾静脉注射到严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内。分别于第1、4、7、14、28天采用生物发光(BLI)成像评估肿瘤生长情况。与接受Scr细胞的小鼠相比，接受NatD敲低细胞的小鼠显示出显著降低的肺癌生长信号(光子辐射)NatD敲低的效果早在第4天就很明显，表明即使在早期阶段，NatD的表达对肺癌细胞的外渗和侵袭也是至关重要的。b.反过来，癌细胞的定植也被显著抑制，研究人员发现在第28天，接受NatD敲低细胞的小鼠肿瘤结节数量相对于接受Scr细胞的小鼠减少了3倍。c.这些发现通过肺内生物发光强度的定量得到了证实。

图4

要点4：a.接下来，研究人员试图确定NatD如何控制癌细胞的迁移和侵袭表型。在TGF-β1诱导的上皮间质转化（EMT）实验中，研究人员观察到具有初始上皮形态的Scr H1299细胞在TGF-β1处理后形成梭形外观和间充质形态。然而，TGF-β1处理的NatD敲低细胞大多保留了其圆形的上皮形态，并且在很大程度上抑制了EMT的发生，尽管并不完全。b.实时定量PCR结果显示，NatD敲低增加了上皮标志物E-cadherin的表达，但降低了间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达。c.Western blot结果显示，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Slug的蛋白水平也发生了一致的变化。d.免疫荧光染色实验进一步证实，与Scr细胞相比，NatD敲低的细胞中E-cadherin染色显著增加，N-cadherin在细胞间连接中减少。e-h.Slug是EMT的关键转录调节因子，通过直接结合CDH1启动子来抑制E-cadherin的表达。因此，研究人员验证了过表达Slug可以补偿NatD敲低的可能性。如预期的那样，NatD敲低的H1299细胞通过异位表达Slug恢复了迁移和侵袭能力，同时伴随着E-cadherin的抑制和N-cadherin和Vimentin的表达增加。i.更有趣的是，在所有分析的NSCLC样本中，Slug和NatD的表达具有良好的相关性。这些结果进一步提示，在肺癌进展过程中，NatD可能正调控Slug表达促进癌细胞侵袭。

图5

要点5：a.以3H-Ac-CoA为乙酰化供体的组蛋白H4N端肽段体外乙酰化实验证实了NatDΔ的乙酰化转移酶活性丧失。b.用抗Nt-ac-H4抗体对Nt-ac-H4进行western blot分析。c.此外，在H1299细胞提取的组蛋白中，野生型NatD能够介导组蛋白H4的Nt-乙酰化，而NatDΔ则不能。在这种情况下，组蛋白H2A上的Nt-乙酰化不受NatDΔ或NatD的调节。d-e.与此一致，研究人员通过定量RT-PCR和western blot检测发现，与野生型NatD细胞相比，NatDΔ细胞中Slug、N-cadherin和Vimentin的表达水平显著降低，E-cadherin的表达水平显著升高。f-g.此外，Transwell实验结果显示，与野生型NatD细胞相比，NatDΔ细胞中肺癌细胞的迁移和侵袭能力显著降低。这些结果表明，NatD对组蛋白H4的Nt乙酰化修饰对于维持肺癌细胞中Slug的表达至关重要。

图6

要点6：a.在NatD敲低的细胞中，与Scr细胞相比，如预期的那样，Nt-ac-H4的水平显著降低。有趣的是，研究人员在总细胞裂解液的Western blot分析中发现，与Scr细胞相比，NatD-KD细胞中组蛋白标记物H4S1ph的水平显著升高。除H4S1ph外，研究人员还观察到NatD-KD细胞中组蛋白标记H4R3me2a较Scr细胞略有升高，而H4R3me2s较Scr细胞略有降低。NatD-KD细胞组蛋白H4K5ac、H4K8ac和减数分裂水平与Scr细胞相比无明显变化。b.研究人员发现，与Scr细胞相比，NatD-KD细胞中Nt-ac-H4在Slug启动子上的富集显著降低。c.研究人员还发现与Scr细胞相比，NatD-KD细胞中H3K4me3的富集水平显著降低，而H3K27甲基化的富集水平显著升高。d-e.重要的是，Nt-ac-H4与H4S1ph之间的拮抗关系依赖于NatD的乙酰转移酶活性。这些结果表明，组蛋白H4S1的Nt-乙酰化和磷酸化是相互拮抗的，组蛋白标记Nt-ac-H4可以与其他组蛋白修饰相互沟通，共同调节Slug基因的表达。

图7

要点7：a-b.研究人员发现NatD敲低细胞中近100%的CK2α定位于细胞核，而在Scr细胞中仅有约70%的CK2α定位于细胞核。蛋白质免疫印迹杂交上NatD敲低细胞胞质中未检测到CK2α的表达，与免疫荧光结果一致。相反，在Scr细胞中，CK2α在细胞质和细胞核中也有表达。c.研究人员用抗CK2α的抗体对pulldown的洗脱液进行了western blot分析。研究人员发现CK2α与非乙酰化的H4肽有明显的结合，而与Nt-ac-H4肽、H4S1A肽和H3肽没有明显的结合。

d-e.研究人员使用在大肠杆菌中表达的纯化的重组CK2α(氨基酸1~335)，通过微量热泳动(MST)实验确定了非乙酰化的H4肽与CK2α直接结合。f.与此结果一致的是，与Scr细胞相比，CK2α在NatD-KD细胞中Slug启动子上的富集显著增加。g-h.事实上，通过RNA干扰敲低CK2α显著增加了Slug的表达，尤其是在NatD-KD细胞中。因此，在肺癌细胞中，组蛋白H4的Nt乙酰化水平下调促进了CK2α的核积累及其与组蛋白H4的结合，导致组蛋白H4丝氨酸1的磷酸化水平增加。这些结果表明，NatD介导的组蛋白H4的N-α末端乙酰化通过阻断CK2α与组蛋白H4的结合，阻止组蛋白H4的丝氨酸1磷酸化。

图8

要点8：组蛋白修饰在基因调控中具有重要作用。然而，组蛋白H4的N-α末端乙酰化修饰的功能一直不确定，尽管这种修饰是丰富的，相应的酶NatD在真核生物中高度保守。在本研究中，研究人员发现NatD介导的组蛋白H4的Nt乙酰化可拮抗丝氨酸磷酸化促进肺癌EMT。这一过程的模型如图所示。肺癌样本中NatD高表达与Slug高表达、侵袭性增强和患者生存期降低相关。这些发现表明，NatD是肺癌进展过程中细胞侵袭的关键表观遗传调控因子。

全文小结

综上所述，本研究证明了NatD介导的组蛋白H4的Nt乙酰化与肺癌进展之间的新联系。研究人员证明NatD介导的组蛋白H4的Nt乙酰化通过表观遗传调控Slug拮抗组蛋白H4的丝氨酸1磷酸化促进肺癌细胞的EMT。NatD是肺癌细胞维持间质表型和促进侵袭所必需的，因此突出了NatD抑制剂作为肺癌患者潜在的早期治疗干预。

参考文献：Ju, J., Chen, A., Deng, Y. et al. NatD promotes lung cancer progression by preventing histone H4 serine phosphorylation to activate Slug expression. Nat Commun 8, 928 (2017). https://doi.org/10.1038/s41467-017-00988-5