IF5.8，iScience│内质网膜和线粒体之间的接触位点调节线粒体DNA的复制和分离前言： 2023年7月21日，加拿大蒙特利尔魁北克三河大学信号研究小组的Marc Germain教授团队在iScience上发表了题为“Contact sites between endoplasmic reticulum sheets and mitochondria regulate mitochondrial DNA replication and segregation”的研究论文，揭示了线粒体和ER片层之间的接触位点，与蛋白质合成相关的ER结构，调节mtDNA在线粒体网络中的复制和分布，明确了内质网片-线粒体接触位点在调控mtDNA复制和分布中的作用。
背景介绍： 线粒体是一种动态的细胞器，调节一系列细胞过程，包括能量产生、细胞代谢、细胞凋亡、钙信号、ROS信号、细胞分化和对病原体的免疫反应。这些线粒体功能受到线粒体动力学、线粒体融合和分裂过程的调控。线粒体动力学对线粒体DNA(mtDNA)的维持至关重要，线粒体融合缺陷会损害mtDNA的完整性和拷贝数。另一方面，尽管线粒体分裂缺陷通常不会影响mtDNA的整体含量，但它会改变拟核(mtDNA-蛋白质复合物)的分布，导致球根状的线粒体结构的形成，即线粒体球。重要的是，线粒体分裂和mtDNA复制都始于线粒体与内质网的接触部位(ERMCS)，这表明内质网在调节线粒体结构和功能方面起着至关重要的作用。 图文解析：
要点1： A-B.线粒体分裂蛋白DRP1的突变或缺失会导致主要存在于细胞核周区域的微管的形成。研究人员在DRP1中间结构域显性负突变的患者原代成纤维细胞中观察到类似的表型，该负突变是DRP1寡聚化所必需的，但在对照细胞线粒体(TMRM)和DNA(Pico Green)中没有观察到类似的表型。 C-D.当用核苷酸类似物EdU标记时，在单个微管中观察到复制型mtDNA的多个拷贝。 E.这表明mtDNA可以在线粒体中主动复制，但不能沿着线粒体网络分布，导致总的拟核体数量减少。与此相一致的是，总的EdU阳性拟核细胞中相当一部分存在于线粒体中。然而，尽管DRP1突变体中总的mtDNA水平并没有降低。 F-G.然而，尽管DRP1突变体中总的mtDNA水平没有降低，但与对照细胞相比，它们具有较少的EdU阳性拟核，这表明DRP1功能的丧失影响了mtDNA的复制。总之，研究人员的数据表明线粒体分裂对于mtDNA的正常复制和分布是必不可少的。
A.为了评估相互作用的特异性，研究人员还对细胞进行了钙黏合素和TOM20的共标记。在钙黏合素和TOM20信号重叠的部位存在清晰的PLA灶，表明真性ERMCS的存在。 B-C.研究人员观察到DRP1突变体中PLA焦点显著增加，表明ERMCS增加。当使用表征良好的IP3R-VDAC PLA对时，也观察到类似的PLA焦点增加。 D-E.由于TEM发现线粒体分裂与内质网小管相关，而内质网小管通常与平滑的内质网相关，因此研究人员首先量化了线粒体与平滑的内质网之间的相互作用。然而，在光滑的ERMCS中，对照组和DRP1突变的成纤维细胞之间没有差异。 F.重要的是，这种相互作用在DRP1突变的成纤维细胞中进一步增强，表现为每个线粒体长度的ERMCS数量和这些ERMCS的长度都增加。 G.在DRP1突变成纤维细胞的FIB-SEM分析中，线粒体和粗糙内质网之间的相互作用也很明显。
要点3： A-B.由于ERsheets大多富集在核周区域，而在核周区域也发现了mitobulbs，因此研究人员使用PLA测量了线粒体和ERsheets之间的相互作用。为此，研究人员使用了内质网膜标记物CLIMP63和线粒体标记物TOM20。如图3A和3B所示，与对照细胞相比，DRP1突变体的线粒体-ER膜相互作用显著增加。 C.为了进一步验证研究人员观察到的内质网膜-线粒体相互作用的变化，研究人员使用超分辨结构光照明显微镜(SIM)观察了用MitoTracker Orange(线粒体)和CLIMP63(内质网膜)标记的细胞。 D.与PLA结果一致，使用曼德斯系数定量，DRP1突变细胞CLIMP63标记的ER膜片与线粒体之间的共定位增加。 E.由于曼德斯系数会受到被测细胞器结构变化的影响，研究人员还测量了两种结构之间的重叠，观察到类似的相互作用增加。总之，研究人员的数据表明，在DRP1突变体中，CLIMP63阳性的ER膜与线粒体之间的相互作用增加。
要点4： A-B.与研究人员使用通用的ER(钙黏合素,IP3R)和ERsheet(CLIMP63)标记的TEM和PLA结果相反，与对照细胞相比，DRP1突变体中RRBP1-SYNJ2BP的接触位点较少。 C.为了进一步确认这一结果，研究人员对线粒体(MitoTracker Orange)和内质网膜(RRBP1)进行了SIM成像。 D-E.与PLA数据一致，研究人员观察到RRBP1阳性的内质网膜与线粒体之间的相互作用显著降低，这是通过曼德斯系数和两个细胞器之间的重叠来衡量的。总之，研究人员的数据表明，虽然DRP1突变的成纤维细胞表现出ERMCS的整体增加，但内质网膜驻留蛋白RRBP1与其线粒体伴侣SYNJ2BP之间的特异性相互作用降低。
要点5： A-B.事实上，绝大多数标记有ATP合酶亚基ATP5A的微管与内质网片密切相关，这支持了内质网片与微管相互作用的观点。 C.为了进一步确认微管与内质网片之间存在物理相互作用，研究人员对CLIMP63(内质网片)和TOM20(线粒体)进行了PLA。 C-D.在内质网片与微管密切接触的部位可见PLA灶，这与两种结构之间的相互作用一致。当使用钙黏合素代替CLIMP63用于PLA时，也观察到类似的结果。 E.与此相一致的是，在SIM图像中观察到了CLIMP63阳性的ER片层与线粒体的密切关联。总之，这些结果表明，微管与内质网片密切相关，暗示了这种相互作用在微管形成中的作用。
图6 要点6： A.由于研究人员的结果表明在DRP1突变的成纤维细胞中，线粒体和ER膜之间的相互作用发生了改变，因此研究人员需确定这是否与ER膜结构的改变有关。为此，研究人员对ERsheets标记物CLIMP63进行了免疫标记对照和DRP1突变体细胞，发现与对照细胞相比，DRP1突变体改变了ERsheets。这些变化的特点是多呈点状，多向四周明显，有时在核周有厚厚的片状。 B.在DRP1突变的成纤维细胞中，ER膜覆盖的整体区域也扩大。 C.在第二个ER膜标记物RRBP1标记的ER膜中观察到类似的改变。 D.总体而言，80%的突变细胞表现出ER膜表型的改变。 E.CLIMP63和RRBP1阳性的ER膜片在SIM成像时也具有碎片化和更多的点状外观。
要点7： A-B.由于mitobulbs的存在与ERsheet的改变之间存在相关性，研究人员接下来确定这些改变是否与mitobulb的形成有关。为此，他们使用了U2OS细胞，一种易于操作的细胞系。研究人员首先证实了在这些细胞中DRP1敲低会导致ER膜的改变和线粒体的形成。 C-D.有趣的是，虽然CLIMP63敲低并没有改变类核体的大小，但它导致了整体类核体数量的减少，这表明合适的内质网膜结构对于类核体的维持是必需的。
要点8： A.在对照组细胞中，CLIMP63的表达不影响线粒体-内质网膜的相互作用，但拯救了DRP1突变细胞中发现的过多的接触位点。 B.同样，在表达CLIMP63的DRP1突变体细胞中，与PLA焦点相关的线粒体数量减少，表明DRP1突变体中ER片层结构的恢复使其与线粒体的相互作用正常化。 C-D.与只表达mCherry的细胞相比，表达mCherry-CLIMP63的DRP1突变体中类核体的大小显著减少，这与CLIMP63的表达刺激了类核体在线粒体外的分布相一致。 E.事实上，虽然mCherry-CLIMP63的表达并没有显著影响对照细胞中的类核数目，但它导致了DRP1突变体中总体类核含量的显著增加。 F.在mCherry转染的DRP1突变成纤维细胞中，几乎所有的线粒体都含有TFAM阳性的拟核，而mCherry-CLIMP63的表达显著减少了这一数量。 G.另一方面，扩大的、球根状的的线粒体结构总数不变，表明在这些条件下DRP1仍然是维持线粒体结构所必需的。 H-I.与CLIMP63类似，mCherry-SYNJ2BP的表达部分挽救了DRP1突变细胞中的核小体缺陷，但不改变对照细胞中核小体的数量和大小。 J.MCherry-SYNJ2BP表达的DRP1突变细胞确实减少了含核小体的球根状的结构的数量，但没有达到mCherry-CLIMP63表达细胞中观察到的程度。 K.这是因为含核小泡的减少与总小泡的类似变化是平行的。总之，研究人员的数据表明核小体分离受内质网膜-线粒体相互作用的调节，而不依赖于DRP1依赖的分裂。
要点9： A-B.在表达mCherry的细胞中，与对照细胞相比，DRP1突变体具有更少的EdU阳性的拟核细胞，表明DRP1是mtDNA正常复制所必需的。重要的是，CLIMP63的表达挽救了DRP1突变细胞中EdU焦点的数量，表明DRP1对拟核体复制的影响是ER膜-线粒体相互作用改变的结果。 C-D.与总EdU计数一致，在DRP1突变的成纤维细胞中CLIMP63的表达导致线粒体DNA中的EdU掺入量显著增加。与研究人员观察到的CLIMP63表达细胞中含核小体的微管数量减少一致，在24h时，CLIMP63表达的DRP1突变细胞中EdU阳性的微管数量减少，而mCherry表达的细胞中没有。重要的是，这并不是因为突变细胞整体EdU染色的丢失。因此，适当的内质网-线粒体相互作用对于调节mtDNA复制和拟核分离至关重要。 本文小结： 综上所述，研究人员的结果证明了ERMCS在mtDNA维持和类核体分布中的重要性。DRP1缺陷后这些接触位点的改变导致了mtDNA的核周积累，这可以解释这些细胞在没有明显代谢改变的情况下观察到的缺陷。 参考文献 Ilamathi H S, Benhammouda S, Lounas A, et al. Contact sites between endoplasmic reticulum sheets and mitochondria regulate mitochondrial DNA replication and segregation[J]. iScience, 2023, 26(7). |
