前言：

2023年6月8日纽约州立大学宾汉姆顿分校的Yuan Wan教授团队在《Nature Communications》杂志上在线发表了题为“Bioinspired engineering of fusogen and targeting moiety equipped nanovesicles”的研究性论文。研究表明使用机械挤压细胞产生的纳米囊泡，降低生产成本，提高批次间均一性，同时模仿病毒颗粒，通过表面装载膜融合蛋白和靶向分子，完成靶向药物胞浆递送。

背景介绍：

细胞来源的小细胞外囊泡已被开发为有效的药物载体。然而，严重的挑战阻碍了它们的临床转化，包括低效率的胞质递送、差的靶向特异性、低产量和生产的不一致性。研究人员发现了一种生物启发材料，工程化的融合剂和靶向部分共功能化的细胞来源的纳米囊泡(CNV)，称为eFT-CNV，作为药物载体。证明通过挤出基因修饰的供体细胞可以产生通用型eFT-CNVs，并且具有较高的产量和一致性。证明了生物启发的eFT-CNVs可以高效、选择性地与靶标结合并触发膜融合，实现内涵体/溶酶体逃逸和胞质药物递送。发现与对应的药物相比，eFT-CNVs显著提高了作用于胞浆靶点的药物的治疗效果。

图文解析：

要点1：

利用CRISPR/cas9敲除内在GPC3和B2M，然后在HEK293细胞膜上共同表达抗GPC3 scFv和工程fusogen。eFT-CNVs是通过机械挤压供体细胞产生的，并装载各种药物，例如核酸、蛋白质毒素或化疗药物，用于靶细胞内递送。

要点2：

a-c.构建转基因HEK293细胞作为供体。获得双纯合子敲除(KO)克隆，并通过Sanger测序进行验证。Western blot证实，成功敲除了内在的GPC3和B2M。随后，转染双KO HEK293细胞，表达膜结合的抗gpc3 scFv。qPCR结果显示，抗gpc3 scFv和fusogen的相对mRNA表达量分别为237,736和1,867拷贝。

d.考虑到工程的融合原含有10个残基的HA标签，流式细胞术进一步验证了融合原中隐藏的HA标签在融合原和抗gpc3 scFv共表达HEK293细胞，即eFTHEK293细胞中可以检测到。所有构建的HEK293菌株也不含支原体。接下来，将pkh26标记的eFTHEK293细胞或gpc3靶向的表达HEK293细胞(即eTHEK293细胞)的scFv植入到培养皿中表达GFP的HepG2细胞中。

e.在pH为5.5的培养基中，融合原通过形成多核多核体诱导细胞-细胞融合。在不含任何融合原的对照组中未观察到细胞融合。大量研究证实，低PH环境是Sindbis病毒融合原介导的膜融合的最佳环境。在另一种情况下，将HepG2细胞与HEK293或eFT-HEK293细胞在悬液中充分混合。没有抗gpc3 scFv存在，没有观察到细胞团聚。此外，PH对细胞团聚没有影响，说明抗gpc3 scFv在酸性较强的条件下并没有明显失去其正确的折叠结构。此外，研究表明，被抗gpc3抗体阻断的HepG2细胞显著丧失了与eFT-HEK293细胞形成微簇的能力，微簇的发生率和大小均较小(方差分析，p<0.05)。总之，成功构建了稳定的eT-HEK293和eFTHEK293细胞，并且膜结合的融合原和靶向片段的功能符合预期。

要点3：

a.通过机械挤压野生型HEK293、eTHEK293和eFT-HEK293细胞制备CNVs、eT-CNVs和eFTCNVs。

b.平均尺寸分别为114.9nm、124.3nm和120.9nm。电镜观察证实，所有囊泡均表现出碟状的特征形态。C.收集到的CNVs、eT-CNVs和eFT-CNVs含有经典的EV标记，包括膜结合蛋白CD81和细胞质蛋白TSG101。

d.接下来，使用仅含有一个抗原结合区域的抗HA标记Fab偶联纳米颗粒来估计eFT-CNV上的fusogen浓度。单个eFT-CNV在质膜上有约7个fusogen分子(n=138)。进一步研究了eFT-CNVs是否可以与表达HepG2的GPC3细胞质膜融合。大约4×10⁴HepG2细胞与eFT-CNVs在数量梯度下共培养30分钟，足以让GPC3抗GPC3 scFv相互作用。

e.HA标签的信号来源于从处理过的HepG2细胞提取的膜蛋白中检测到fusogen E2结构域。含E2结构域的HA标签分子量为49kDa。理论值与实验结果一致。随着eFT-CNVs数量的增加，HA标记的频带强度增加。根据信号强度，半定量数据表明，每组中有574、126和59个融合原分子与HepG2细胞融合。聚变效率分别为22.9%、50.4%和100%。eFT-CNV组具有极高的融合效率，这是由于仅80µl的悬液中eFT-CNV的含量很低，并且孔中有足够的HepG2细胞。因此，几乎所有的eFT-CNV都能通过抗gpc3 scFv有效地与HepG2细胞结合并融合到质膜上。还在不同的时间间隔内培养了1×10⁸个eFT-CNVs的HepG2细胞。共培养20分钟后，足够数量的eFT-CNVs融合到HepG2质膜上，超过了western blot的最低检测限。推测，eFT-CNVs可以在几秒钟内与最近的HepG2细胞结合，然后进行融合原诱导的膜融合。值得注意的是，western blot固有的局限性可能无法提供eFT-CNVs与HepG2细胞融合效率的准确数据。荧光成像技术也有这些局限性。然而，表征表明，eFT-CNVs可以在20分钟内附着并融合到靶细胞膜上。随后，使用细胞测定来验证eFT-CNVs是否可以逃避溶酶体的吞噬。

f.共培养30分钟后，PKH67标记的CNVs在没有抗gpc3 scFv的情况下几乎没有被占用。虽然平均8.3个eT-CNV快速附着在HepG2细胞表面，但这些没有膜结合融合原的囊泡被内吞通过LysoView染料染色HepG2细胞，维持纳米颗粒的形态。相反，只有少数eFT-CNV被内吞。大多数eFT-CNVs与HepG2细胞膜融合，并在整个细胞中呈现色散的绿色荧光。200个细胞的平均荧光强度为22.4。相比之下，共培养30分钟后，CNVs、eT-CNVs或eFT-CNVs不能有效地粘附在GPC3KO HepG2细胞膜上。进一步用表达MCF7的GPC3细胞分别培养CNV、eT-CNV和eFT-CNV。同样，CNVs几乎不附着在MCF7细胞膜上;平均3.7eT-CNVs通过抗gpc3 scFv粘附在MCF-7细胞膜上，但未触发膜融合;只有eFT-CNVs与MCF7细胞膜结合融合，平均荧光强度为7.8。值得注意的是，在MCF7细胞中鉴定到的eT-CNV的平均数量明显低于过表达GPC3的HepG2细胞。eFT-CNVs处理MCF7细胞的平均绿色荧光强度也低于HepG2细胞。这些发现与两种细胞系中GPC3表达水平的差异一致。对GPC3介导的内吞作用的进一步分析表明，网格蛋白介导的内吞作用、微胞饮作用和小泡介导的内吞作用参与了eT-CNV的内化过程。

g.最后，收获了hepg2衍生的表达ev的GPC3，并将其与eFT-CNV以1:1的比例混合。宏观团聚在不到30分钟的时间内形成

h.TEM图像进一步验证了eFT-CNV与HepG2 ev之间的膜融合。荧光共振能量转移实验证实了融合，在pH5.5条件下，30min内的平均融合效率为64.7%。

要点4：首先，验证了siR-Sox2和游离gelonin的治疗效果。CCK8实验表明，在48h时，负载siR-Sox2的CNV在2×10⁸-1.28×10¹⁰范围内抑制了HepG2细胞的增殖，证明了siR-Sox2的抗癌作用。相比之下，等量的模拟sirna负载CNVs没有表现出显著的细胞毒性。

a.还证实游离明胶降低了核糖体活性。游离胶的IC₅₀为16pM，与文献报道值接近。接下来，将药物装载到3×10⁹CNVs、eT-CNVs和eFT-CNVs中，并研究细胞内给药是否可以提高治疗效果。

b.qPCR数据显示，装载siR-Sox2的eFT-CNVs(相当于200nM siR-Sox2)将Sox2 mRNA水平降低至17.6%。相比之下，CNV组和eT-CNV组Sox2 mRNA的表达量分别下降至75.7%和62.6%。同样，Sox2蛋白在CNV组的表达下降到98%，eT-CNV组的表达下降到76.4%，eFT-CNV组的表达下降到32.8%。mRNA和蛋白的表达数据表明，siRSox2负载的eFT-CNVs可以更有效地沉默HepG2细胞中的Sox2基因。

c.进一步使用200nM游离紫杉醇、三种负载紫杉醇的纳米囊泡和阴性对照来治疗HepG2细胞。在紫杉醇负载CNV组、eT-CNV组和eFT-CNV组中，74.5%、85.1%和86.9%的细胞在G2/M期被有效阻断。相比之下，在游离紫杉醇组，只有45.4%的细胞保留在G2/M期(方差分析，p<0.001)。此外，eT-CNVs和eFT-CNVs比CNVs更有效地将紫杉醇输送到HepG2(AVOVA,p<0.05)。eT-CNV组与eFT-CNV组治疗效果无显著差异。考虑到HepG2细胞中核糖体活性的直接评价比较困难，gelonin的蛋白合成抑制功能没有被直接研究。

d.测定了三种纳米囊泡中游离药物和载药的IC₅₀。用等量的siR-Sox2与载药CNVs和eT-CNVs相比，载药eFT-CNVs的治疗效果分别提高3.9倍和1.4倍。相反，游离siR-Sox2对细胞活力没有显著影响。与游离gelonin、CNV和eT-CNV组相比，gelonin-eFT-CNV组的治疗效果分别提高了40倍、8.1倍和2.5倍(方差分析，p<0.05)。同样，与游离紫杉醇、CNV和eT-CNV组相比，负载紫杉醇的eFT-CNVs显著提高了治疗效果，分别提高了25.6倍、4.1倍和1.7倍(方差分析，p<0.05)。

e.还进行了伤口愈合实验，并证明负载药物的纳米囊泡处理后HepG2细胞的伤口闭合率降低。负载siR-Sox2的eFT-CNVs显著抑制HepG2细胞迁移，分别是23.8倍、17.5倍和15.9倍siR-Sox2、CNV和eT-CNV组(方差分析，p<0.0001)。Gelonin和紫杉醇负载的eFT-CNVs对HepG2细胞迁移的抑制作用约为1.5倍(方差分析，p<0.05)。

f.EdU实验证实，负载药物的纳米囊泡可以更有效地抑制HepG2细胞。更具体地说，与CNV和eT-CNV组相比，eFT-CNV组HepG2的增殖率比siR-Sox2组降低1.7倍和1.6倍，比gelonin组降低1.6倍和1.5倍，比紫杉醇组降低1.4倍和1.1倍(方差分析，p<0.05)。经井侵袭实验显示，载药纳米囊泡可显著抑制HepG2细胞的侵袭。与CNV和eT-CNV组相比，eFT-CNV组侵袭HepG2的数量比sirsox2组减少3.4倍和2.5倍，比gelonin组减少3.9倍和1.3倍，比紫杉醇组减少5.6倍和1.6倍(方差分析，p<0.05)。

h.进一步研究了载药纳米囊泡在体内的治疗效果。在siR-Sox2组中，PBS和游离siR-Sox2处理小鼠的肿瘤体积从第0天的~250mm3迅速增加到第28天的1600mm³。同时，CNV组、eT-CNV组和eFT-CNV组的最终肿瘤体积分别为1060.5±259.3mm³、777.1±133.8mm³和101.6±26.4mm³。eFT-CNV组肿瘤体积与其他4组比较差异有统计学意义(方差分析，p<0.01)。与游离siR-Sox2、CNV和eT-CNV组相比，eFT-CNV组siR-Sox2的体内治疗效果分别提高了15.7倍、10.4倍和7.7倍。游离siR-Sox2在体内不能有效杀伤肿瘤。相反，装载siR-Sox2的eFT-CNVs显著抑制了移植物肿瘤的生长，这可能是由于其活性靶向作用和细胞内给药。凝胶处理组也有类似现象。PBS组、gelonin组、CNV组、eT-CNV组和eFT-CNV组的最终肿瘤体积分别为1353.6±271.6mm3、1386±314.2mm3、560.8±99.7mm3、377.1±83.2mm3和40.6±16.4mm3。与gelonin、CNV和eT-CNV组相比，gelonin-eFT-CNV的体内治疗效果分别提高了34.1倍、13.8倍和9.3倍。紫杉醇治疗的肿瘤显示出适度的生长抑制;肿瘤体积增大至386.7±75.4mm³。相比之下，负载紫杉醇的纳米囊泡抑制肿瘤生长，最终肿瘤体积分别为205.3±29.7mm³,43.6±23.2mm³和4.6±2.7mm³。与游离紫杉醇、CNV和eT-CNV组相比，负载紫杉醇的eFT-CNV的体内治疗效果分别提高了84.1倍、44.6倍和9.5倍。在给药3周期间，五组患者体重无显著差异。进一步分析各组肿瘤的组织学结构。与其他组相比，载药eFT-CNVs对肿瘤组织造成明显损伤，表明治疗效果增强。用载药eFT-CNV处理的每个受试者的主要器官进一步采集组织样本进行组织学分析。没有观察到广泛的损伤，表明载药的eFT-CNVs可以降低全身毒性。荷瘤小鼠可以接受更高剂量的eFT-CNV载药，获得更好的治疗效果，全身毒性处于可接受的水平。在给药4周期间，小鼠体重没有显著差异。此外，负载紫杉醇的eFT-CNVs继续在肿瘤中积累。

i.它们在24h时间点达到浓度峰值，与紫杉醇组的药代动力学差异显著(T检验，p<0.01)。

本文小结：

综上所述，eFT-CNVs可以逃避内吞囊泡并直接将药物递送至胞质溶胶来进一步提高治疗效果。除了药物输送之外，所开发的eFT-CNVs还可用于细胞编辑和疫苗应用。此外，与脂质纳米颗粒相比，具有低免疫原性的mRNA负载的eFT-CNVs可以有效地将mRNA递送至胞质溶胶，因此可作为潜在的疫苗载体进行探索。总体而言，融合剂和癌症靶向部分共同功能化的纳米囊泡作为药物载体可以显着增强作用于细胞质靶点的药物的治疗效果。可能成为纳米医学和精准医学领域有价值且有前途的工具。

参考文献：

Wang, L., Wang, G., Mao, W. et al. Bioinspired engineering of fusogen and targeting moiety equipped nanovesicles. Nat Commun 14, 3366 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39181-2