IF13.995，Science Advances│D-乳酸调节M2肿瘤相关巨噬细胞并重塑肝细胞癌的免疫抑制性肿瘤微环境前言：2023年7月19日，吉林大学郭建锋及上海中医药大学余卓共同通讯在Science Advances发表了题为“D-lactate modulates M2 tumor-associated macrophages and remodels immunosuppressive tumor microenvironment for hepatocellular carcinoma”的研究论文,该研究揭示D-乳酸调节M2肿瘤相关巨噬细胞并重塑肝细胞癌的免疫抑制性肿瘤微环境。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）从M2向M1表型的极化显示了重塑HCC免疫抑制性TME的巨大潜力。D-乳酸作为内源性免疫调节剂，增强库普弗细胞清除病原体。
研究背景： 肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌，每年都在增加，全球新增发病率和死亡率分别超过90万和80万。免疫疗法为不同的癌症提供了巨大的希望。然而，肝脏高度暴露于抗原和内毒素，这种体内平衡的机制导致肝脏对特定抗原的免疫反应(称为免疫耐受)被阻止。此外，肝细胞癌的发生通常是由慢性炎症、纤维化和肝硬化引起的。这些病理条件产生的状态，在这种状态下，完全激活的效应免疫细胞无法诱导针对肝细胞转化和肿瘤细胞增殖的生产性免疫反应(称为免疫无知)。由于这些原因，HCC表现出免疫抑制肿瘤微环境(TME)，对免疫治疗有抵抗力。 图文解析：
图1 要点1： A.在本研究中，DL将TAM从M2切换到M1，这主要是由于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路的抑制和核因子κB(NF-κB)通路的激活。 B.此外，本研究还开发了一种靶向肝癌膜包被的M2巨噬细胞结合肽(M2pep)聚乳酸-羟基乙酸酯(PLGA)纳米颗粒(NP)，用于将DL输送到HCC内的M2 TAMs中。由此产生的纳米制剂(称为DL@NP-M-M2pep)通过HCC膜相关的归巢功能在肿瘤内积累，并通过m2pep介导的靶向能力将DL转运到M2 TAMs，共同导致M2 TAMs转化为M1，并在同种异体移植和致癌诱导的原位HCC小鼠模型中重塑免疫抑制的TME。此外，抗CD47抗体与DL@NP-M-M2pep联合治疗肝癌小鼠实现了癌变诱导的原位肝癌小鼠的长期存活，为肝癌的联合治疗提供了一条途径。
图2 要点2： A.使用骨髓(BM)来源的巨噬细胞(bmdm)来评估DL对巨噬细胞极化的能力极化,包括巨噬细胞(BMDMs)刺激的IL-4(M2巨噬细胞)或干扰素-γ(IFN-γ)和脂多糖(LPS)。这些M2或M1巨噬细胞可能类似于M2或M1 TAMs，因此被广泛用于TAM相关研究。 B.RNA测序分析结果显示，当DL处理M2巨噬细胞时，M2相关基因(如Arg1、Cd163、Cd206、Fizz、Il-10、Mmp2和Smad3)显著下调，而m1相关基因(如Ccl5、Cxcl9、Cxcl10、Nos、Il-1β、IL-12、Tlr2、Tlr9和Tnf-α)显著上调。 C.利用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)证实了巨噬细胞极化相关基因的表达。DL处理M2巨噬细胞时，M2功能标记物[精氨酸-1(Arg-1)、Fizz、IL-10]的表达显著下调，M1功能标记物[TNF-α、iNOS(诱导性一氧化氮合酶)、IL-12]的表达显著上调。 D.流式细胞术结果显示，DL处理M2巨噬细胞后，CD206+ F4/80+群体(M2表型)显著减少，而CD86+ F4/80+群体(M1表型)显著增加。 E.M1和M2巨噬细胞表现出不同的形态结构，这与先前报道的M1和M2巨噬细胞相似(DL改变了M2巨噬细胞的形态，使其变得与M1巨噬细胞相似）。结果表明DL将M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞。
图3 要点3： A-B.用M2巨噬细胞研究了DL对巨噬细胞极化作用的机制。基于基因本体的功能分析和KEGG显示了DL调控的基因产物在PI3K/AKT通路上的富集。 C.在DL处理的M2巨噬细胞中，与PI3K/AKT通路相关的基因产物发生了显著变化，在该通路中有33个基因上调，64个基因下调。这些结果表明PI3K/AKT通路与DL介导的巨噬细胞极化密切相关。 D.在DL处理的M2巨噬细胞中，PI3K和AKT1活性明显。AKT1的两个下游转录因子，转录6的信号转导和激活因子(STAT6)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)也显著失活。PI3K/Akt1通路的下调也显著抑制了ARG-1和FIZZ(两个关键M2功能因子)的表达。相比之下，DL处理后M2巨噬细胞中AKT2的活性显著增强。AKT2的两个下游转录因子STAT1和NF-κB也显著被激活。iNOS和TNF-α(两个M1关键功能因子)的表达也显著上调。 E.DL在toll样受体2(TLR2)和TLR9上的结合构象通过分子对接预测。结果表明，DL可能通过疏水相互作用(Trp529、His531、Ala507、Lys505和Arg486)和氢键(Tyr483和Ser485)与TLR2相互作用;DL可能通过疏水相互作用(His394、Arg418、Phe419和Lys472)和氢键(Thr395和Asn473)与TLR9相互作用。 F.在M2巨噬细胞中，通过预处理TLR2和/或TLR9抑制剂进一步证实DL与TLR2和/或TLR9的相互作用。结果显示，TLR2抑制剂、TLR9抑制剂或两者均可显著消除DL对PI3K和NF-κB活性的影响。 G.DL与TLR2和/或TLR9相互作用，诱导PI3K/AKT通路的抑制和NF-κB通路的激活，促进巨噬细胞从M2向M1极化。
图4 要点4： A-B.在这项研究中，开发了一种靶向M2pep的HCC膜包被PLGA NP，以利用外源性DL在体内传递到TME内的M2 TAMs。在用插入M2pep的HCC膜包覆负载dl的NPs(称为DL@NP)之后，靶向仿生纳米制剂(称为DL@NP-M-M2pep)展示了“膜核”纳米结构，这与非靶向对应物(DL@NP-M)相似。 C-D.DL@NP-M-M2pep(以及DL@NP-M)的膜厚度为17nm，与天然癌细胞膜的厚度相近。此外，DL@NP-M-M2pep的粒径为120nm[聚合物分散指数(PDI)≈0.3]，表面电荷为−11mV，与DL@NP-M相似。值得注意的是，DL@NP-M-M2pep的粒径(120nm)大于DL@NP(105nm)，PDI≈0.1，差异(15nm)与透射电子显微镜(TEM)观察到的膜厚度(17nm)相似。这些结果表明DL@NP涂层成功地形成了DL@NP-M和DL@NP-M-M2pep。 E.此外，DL@NP、DL@NP-M和DL@NP-M-M2pep获得了相似的负载能力(LC)(7wt%)，这表明纳米配方的完整性不受HCC膜涂层的影响。当DL@NP-M-M2pep在中性磷酸盐缓冲盐水(PBS)中孵育进行稳定性评估时，大小和电荷没有明显波动。 F.在中性环境(pH7.4)孵育8小时后，DL@NP-M-M2pep中DL的释放量约为2%，而在酸性环境(pH5.5)中DL的释放量显著增加(约20%)。孵育24小时后，分别在pH7.4和5.5下从DL@NP-M-M2pep中释放出10%和60%的DL。48小时后，15%和80%的DL分别在pH7.4和5.5下从DL@NP-M-M2pep中释放出来。pH敏感性药物释放可能是由于PLGA基NPs在低pH环境下通过自催化降解引起的。
图5 要点5： A.IL-4刺激BMDM衍生的M2巨噬细胞已被用于研究M2pep靶向NPs的递送效果。在本研究中，利用流式细胞术评估DL@NP-M-M2pep在M2巨噬细胞中的靶向递送能力。结果显示，与PBS和DL@NP-M相比，DL@NP-M-M2pep在M2巨噬细胞中的细胞摄取显著增加。此外，利用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)评估DL@NP-M-M2pep在M2和M1巨噬细胞中的靶向递送能力。因此，DL@NP-M-M2pep对M2巨噬细胞的内化显著高于M1巨噬细胞。这些结果证实了M2pep介导的药物传递潜力。 B.随后，在M2巨噬细胞中证实DL@NP-M-M2pep对巨噬细胞极化的作用。在PI3K、AKT1、STAT6和PPAR-γ的活性方面，与PBS和DL@NP-M相比，DL@NP-M-M2pep显著下调PI3K/AKT通路的活性(P<0.0001)。相比之下，在AKT2、STAT1和NF-κB的活性方面，DL@NP-M-M2pep与PBS和DL@NP-M相比，NF-κB通路的活性显著上调。 C.在PI3K/AKT通路被抑制后，DL@NP-M-M2pep显著下调m2相关因子Arg1、Fizz、TGF-β、IL-10的表达。 D.相反，激活NF-κB通路后，m1相关因子Il-1β、TNF-α、iNOS、IL-12的表达明显上调。因此，结果证实了DL@NP-M-M2pep在M2巨噬细胞特异性传递DL以实现M2到M2转化方面的潜力。
图6 要点6： A.使用健康小鼠(n=6)研究了DL@NP-M-M2pep的体内毒性。结果显示，与PBS和游离DL相比，多次静脉注射DL@NP-M-M2pep(100mM DL)后，体重没有明显减轻。 B.此外，与PBS相比，DL@NP-M-M2pep处理小鼠的主要器官(心、肝、脾、肺、肾)未见明显损伤。同时进行肝肾功能分析，进一步评估全身毒性。 C.与PBS相比，血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)水平通过DL@NP-M-M2pep没有显著升高。这些结果证实纳米制剂在体内应用的安全性。 D.随后，在Hepa1-6-luc来源的原位HCC小鼠中评估了游离DL和负载在纳米制剂中的DL的半衰期。结果显示，与游离DL相比，DL@NP-M-M2pep内DL的血液循环时间明显延长。 E.此外，还使用Hepa1-6-luc来源的原位HCC小鼠评估了DL@NP-M-M2pep的生物分布。静脉注射含DiR纳米制剂24小时后，对主要器官和肝脏肿瘤进行成像。结果显示，与DL@NP相比，在肝脏肿瘤内部观察到DL@NP-M-M2pep显著，这是通过将纳米制剂(用DiR标记)递送到肿瘤中证实的(由HCC细胞中荧光素酶催化荧光素氧化引起的发光表明)。相比之下，DL@NP-M-M2pep在肺、脾脏和肾脏中的分布明显少于DL@NP。 F.此外，DL@NP-M与DL@NP-M-M2pep表现出相似的半衰期和生物分布。此外，使用CLSM研究DL@NP-M-M2pep的TAMs靶向递送能力。如图6F所示，M2型TAMs中DL@NP-M-M2pep的水平显著高于M1型TAMs。这些结果证实DL@NP-M-M2pep，由于基于HCC膜和M2pep靶向修饰，改善了血液循环、肿瘤归巢和TAM靶向。
图7 要点7： A.为了证实DL可能使M2 TAMs向M1极化并重塑HCC中免疫抑制TME的假设，首先在Hepa1-6-luc衍生的原位HCC小鼠模型中进行了治疗研究。结果显示，与PBS相比，游离DL(外源性DL)略微减缓了肿瘤生长，而与PBS和游离DL相比，DL@NP-M显著延缓了肿瘤发展。 B-C.值得注意的是，与游离DL和DL@NP-M相比，DL@NP-M-M2pep在21天内进一步抑制了肿瘤生长。 D.与PBS(中位生存≈13天)、游离DL(中位生存≈16天)和DL@NP-M(10只小鼠中有1只>90天)相比，DL@NP-M-M2pep显著提高了动物存活(10只小鼠中有6只>90天)。值得注意的是，空白NPs对肿瘤生长没有影响，这表明DL@NP-M-M2pep的治疗效果是由于DL而不是空白NPs。随后，DL@NP-M-M2pep对巨噬细胞调节抗HCC治疗的疗效得到证实。 E.免疫荧光染色结果显示，与PBS(18%)、游离DL(15%)和DL@NP-M(6%)相比，DL@NP-M-M2pep显著减少了肿瘤内F4/80+ Arg1+ M2 TAMs(2%)的数量(2%);相比之下，与PBS(0.1%)、游离DL(1%)和DL@NP-M(4%)相比，DL@NP-M-M2pep显著提高了肿瘤内F4/80+ iNOS+ M1的数量(9%)。 F.使用不同的M2和M1 AMs标记物进一步证实DL@NP-M-M2pep对巨噬细胞调节的作用。与PBS(28%)、游离DL(21%)和DL@NP-M(8%)相比，DL@NP-M-M2pep显著减少了肿瘤内F4/80+ CD206+ M2 TAMs的数量(2%);相比之下，与PBS(0.2%)、游离DL(5%)和DL@NP-M(12%)相比，DL@NP-M-M2pep显著提高了肿瘤内F4/80+ CD86+ M1的数量(25%)。此外，流式细胞术结果显示，与PBS、游离DL和DL@NP-M相比，DL@NP-M-M2pep显著减少了肿瘤内F4/80+ CD206+ M2 TAMs的数量;与其他对照组相比，DL@NP-M-M2pep显著增加了肿瘤内F4/80+ CD86+ M1基因的数量。这些结果表明DL@NP-M-M2pep使TME内的M2 TAMs向M1极化。
图8 要点8： A.TAM极化后，对DL@NP-M-M2pep重塑免疫抑制TME的能力进行了评估。流式细胞术结果显示，与PBS、游离DL和DL@NP-M相比，肿瘤内MDSCs和Tregs等免疫抑制细胞DL@NP-M-M2pep显著下调;相比之下，免疫刺激细胞，包括NK细胞、活化的树突状细胞(DCs)、CD8+细胞毒性和记忆T细胞、CD4+辅助和记忆T细胞，在肿瘤内通过DL@NP-M-M2pep显著上调。 B-C.由此可见，DL@NP-M-M2pep对免疫抑制细胞的下调显著降低了IL-10、TGF-β、IL-4等免疫抑制因子的表达，DL@NP-M-M2pep对免疫刺激细胞的上调显著提高了IFN-γ、TNF-α、IL-12等免疫刺激因子的表达。
图9 要点9： A.抗CD47抗体(α-CD47)和纳米制剂的联合功效在致癌物诱导的原位HCC小鼠中进行评估。结果显示，与PBS相比，α-CD47显著减缓了肿瘤的发展，而DL@NP-M-M2pep的抗hcc效果显著优于α-CD47。 B-D.α-CD47和DL@NP-M-M2pep联合使用比单一治疗进一步抑制了肿瘤的生长，导致动物生存期更长(10只小鼠中有5只>60天)，中位生存期≈10天)。α-CD47(中位生存期≈18天)，DL@NP-M-M2pep(中位生存期≈40天)。 E.流式细胞术结果显示，与PBS和α-CD47相比，DL@NP-M-M2pep显著减少了肿瘤内M2 TAMs(F4/80+ CD206+)的数量,而DL@NP-M-M2pep和α-CD47联合使用进一步减少了M2 TAMs的数量。此外，与PBS和α-CD47相比，DL@NP-M-M2pep显著提高了肿瘤内M1(F4/80+ CD86+)的数量，而DL@NP-M-M2pep和α-CD47联合使用进一步增加了M1的数量。在巨噬细胞极化后，联合策略将免疫抑制的TME显著重塑为免疫刺激，并伴有MDSCs和Tregs的下调，以及NK细胞、活化的DC和效应T细胞的上调。 F.因此，与PBS、α-CD47(9%)和DL@NP-M-M2pep(43%)相比，联合获得的免疫抑制性TME转化显著诱导肿瘤凋亡(78%)。这些结果证实了纳米制剂能够调节巨噬细胞极化，重塑免疫抑制的TME，与α-CD47联合可显著提高抗HCC的疗效，为HCC的联合治疗提供了一种很有前景的方法。 本文小结： 综上所述，研究证实了DL将M2 TAM转化为M1的潜力，这种极化的机制主要是由于磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B途径的调节。采用丙交酯-乙交酯共聚物纳米颗粒（NP）负载DL，并用HCC膜和M2巨噬细胞结合肽（M2pep）对负载DL的NP进行修饰，形成纳米制剂（DL@NP-M-M2pep )。DL@NP-M-M2pep将 M2 TAM 转化为 M1，并重塑了 HCC 小鼠中的免疫抑制 TME，提高了抗 CD47 抗体对动物长期生存的功效。研究揭示了 DL 的潜在 TAM 调节功能，并为临床应用HCC 免疫治疗提供了组合策略。 参考文献： Shulan Han et al. ,dlactate modulates M2 tumorassociated macrophages and remodels immunosuppressive tumor microenvironment for hepatocellular carcinoma.Sci. Adv.9,eadg2697(2023). 网址：https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adg2697 |
