IF 38.079，Cell Discovery│核PD-L1促进EGR1介导的血管生成，加速肿瘤发生发展

前言：

2023年3月28日，上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科范先群院士团队在Cell Discovery发表题为“Nuclear PD-L1 promotes EGR1-mediated angiogenesis and accelerates tumorigenesis”的研究论文。研究发现，葡萄膜黑色素瘤(UM)细胞核程序性死亡配体1(PD-L1)比例升高，并通过转录激活早期生长应答因子1(EGR1)表达，促进肿瘤血管新生；抗PD-L1免疫治疗联合组蛋白脱乙酰基酶2(HDAC2)抑制剂减弱UM的肿瘤血管生成。提出了一种新的抗肿瘤血管生成的治疗策略。

背景介绍：

肿瘤免疫治疗是继化疗放疗、靶向治疗后，肿瘤治疗史上的第三次革命。其中，PD-L1是最为关键的肿瘤免疫抑制分子之一。肿瘤细胞膜表面的PD-L1通过与微环境中T细胞膜上的程序性死亡受体1(PD-1)相互作用，抑制T细胞的增殖及其活化，从而介导了肿瘤细胞发生免疫逃逸，肿瘤细胞脱离控制而迅速生长、转移。近十年来，抗PD-1/PD-L1的免疫治疗已经在肿瘤治疗中取得了明显可见的成效。然而，UM中抗PD-L1疗效不佳，在最大的多中心回顾性队列中，9个不同学术中心的58例转移性葡萄膜黑色素瘤患者接受抗PD1或抗PD-L1抗体治疗，仅3.6%的UM患者对治疗敏感，中位无进展生存期和总生存期分别为2.8和7.6个月，没有观察到生存期获益。PD-L1可以进入细胞核，发挥非免疫检查点调控的促癌作用。研究发现，乳腺癌细胞膜上PD-L1的第263位赖氨酸可以发生乙酰化修饰。被HDAC2去乙酰化的PD-L1可以经核孔进入细胞核，转录激活逃避免疫监视相关通路的基因表达，从而影响PD-L1阻断疗法效果。提示细胞核PD-L1具有重要的促癌功能，可能是抗PD-L1免疫治疗耐受的重要原因。但PD-L1在UM中的分布特征和功能尚不清楚。

图文解析：

图1

要点1：

a.为了研究PD-L1在不同类型的黑色素瘤中的亚细胞定位，在30例UM病例、42例结膜黑色素瘤（CoM）病例和35例皮肤黑色素瘤（SKCM）病例中进行了免疫荧光（IF）染色。值得注意的是，观察到57%（17/30）的UM，26%（11/42）的CoM和40%（14/35）的SKCM样本呈阳性PD-L1信号（>5%的细胞表达PD-L1，PD-L1⁺）。

b-c.有趣的是，几乎所有的PD-L1在CoM和SKCM中都定位在细胞膜上，这与这些肿瘤对抗PD1/PD-L1治疗的良好反应一致。然而，对于PD-L1阳性的UM，有7例其中大部分PD-L1定位在细胞核内。

d.重要的是，升高的细胞核PD-L1强度与早期肿瘤复发有关（log-rank P<0.05）。有趣的是，癌症基因组图谱（TCGA）数据库显示，UM中较高的PD-L1水平与不良预后相关，但对于SKCM则是有利的结果，这与观察到的PD-L1在这两种黑色素瘤之间分布不同的情况完全一致。此外，对不同的黑色素瘤细胞系进行了PD-L1表达的测试。发现两种UM（MUM2B和MEL290）和三种SKCM（A375，M21和LOX-IMVI）细胞系呈阳性PD-L1信号。

e-g.同样的，通过Western blotting检测和免疫荧光（IF）检测细胞质/膜（C/M）和细胞核（N）部分，发现PD-L1丰富地分布在UM细胞的细胞核中，但仅在SKCM细胞的细胞膜中定位。总体而言，这些数据表明nPD-L1在UM样本和细胞系中显著升高，而在其他类型的黑色素瘤中没有升高。

图2

要点2：

a-c.为了确定nPD-L1在UM发病机制中的功能，设计了两个独立的shRNA来沉默PD-L1。研究发现，在shRNA转染后，PD-L1的表达显著减弱，这通过实时定量PCR（qRT-PCR）、Western blotting、免疫荧光染色和RNA测序（存储在GEO数据库：GSE202884）实验得到证实。

d.重要的是，PD-L1沉默不会改变所有经过测试的UM细胞系的增殖、集落形成能力或细胞迁移能力。考虑到脉络膜是由内皮细胞（ECs）形成的眼内血管，并且“血管生成转换”促进了恶性转化，在UM的肿瘤发生过程中起着重要的作用，接下来测试了nPD-L1在肿瘤中的作用-UM肿瘤发生过程中ECs的相互作用。

e-h.令人注目的是，与沉默PD-L1 UM细胞来源的条件培养基共培养后，人脐静脉内皮细胞系（HUVEC）显示出较低的迁移和血管形成能力。

i.此外，进行了鸡胚绒毛膜（CAM）实验测定，并使用荧光素酶标记的PD-L1敲低UM细胞生成原位异种移植瘤，以评估PD-L1在体内血管生成中的作用。PD-L1沉默UM细胞在CAM实验中显示出较低的促血管生成能力。

j.有趣的是，观察到大多数原位异种移植瘤在对照组中被丰富的血管所包围；然而，在PD-L1沉默UM组中几乎没有可见的血管。

k-l.同样的，在PD-L1沉默的异种移植瘤中，发现CD31信号（血管生成的标志物）减弱。

m-n.此外，动物生物发光成像显示PD-L1沉默组中肿瘤信号减弱，这与PD-L1沉默后血管生成能力的减弱一致。

o-p.PD-L1沉默组的肿瘤大小和重量也显著低于对照组。这些数据表明nPD-L1可以促进UM的血管生成，无论是体外还是体内。已有研究表明，可溶性PD-L1有助于免疫逃逸，与恶性黑素瘤的晚期（IV期）相关。随后将重组PD-L1添加到PD-L1缺失的UM细胞中，浓度为10µg/mL，培养72小时。然而，HUVEC迁移和血管形成实验显示，重组PD-L1未能恢复PD-L1缺失细胞的促血管生成功能。由于分泌型PD-L1不分布在细胞核内，这一观察进一步表明细胞核PD-L1具有促血管生成的功能，而不是其可溶性形式。进一步采用了两个独立的sgRNA来完全删除内源性PD-L1。与PD-L1-shRNA处理的细胞一致，PD-L1敲除也不会改变增殖、集落形成能力或细胞迁移能力。此外，与对照细胞相比，PD-L1敲除细胞表现出较低的促进HUVEC迁移能力和血管形成能力。这些数据进一步表明，细胞核PD-L1促进UM的血管生成，而不是调节肿瘤细胞的增殖、集落形成和迁移能力。

图3

要点3：

a-c.为了揭示nPD-L1促血管生成功能的机制，首先通过沉默PD-L1进行RNA-seq实验，并观察到转录模式发生了显著变化，下调基因177个，上调基因73个。基因组富集分析显示这些异常表达的基因主要富集在与肿瘤相关的通路中。此外，使用抗PD-L1抗体进行CUT&Tag实验，可视化基因组中nPD-L1的分布。鉴定了1144个nPD-L1结合位点，这些位点主要分布在转录起始位点（TSS）附近，表明nPD-L1具有转录调控功能（GEO数据库编号：GSE202394）。

d.值得注意的是，结合CUT&Tag和RNA-seq数据，发现17个基因在其启动子上显示出PD-L1结合信号，并且在沉默PD-L1后mRNA表达下调。此外，这17个基因中，只有3个基因在肿瘤中表达上调（|FC|>2，P<0.05），包括EGR1，它是一种促血管因子的正调节因子。

e.在UM中，EGR1与TCGA队列中血管生成信号通路的GSVA得分显著正相关（R=0.30，P=0.0075），表明EGR1在UM中具有促血管生成调节因子的功能。

f.然后，重点研究了nPD-L1在EGR1基因座中的调控作用。CUT&Tag数据显示EGR1启动子中存在明确的PD-L1峰值，表明nPD-L1位于EGR1启动子中。

g.此外，RNA-seq数据的色谱图表明PD-L1沉默细胞中EGR1表达减弱。

h-i.与这些高通量结果一致，ChIP-qPCR实验证实了PD-L1与EGR1启动子的结合，并且在PD-L1沉默细胞中结合水平下降。

j.有报道称EGR1可能促进VEGFA的表达来促进血管生成。PD-L1沉默细胞中EGR1和VEGFA的表达在mRNA和蛋白水平上显著降低。

k-l.源自PD-L1沉默细胞的原位异种移植瘤也显示出EGR1表达受限。总的来说，这些发现表明EGR1可能被nPD-L1转录激活。

图4

要点4：

EGR1是一种经典的促血管生成调节因子，但其在UM中的功能尚不清楚。因此，首先在UM细胞中通过shRNA沉默EGR1，并观察到VEGFA表达显著降低，包括mRNA和蛋白水平。此外，从EGR1缺陷细胞中获得的条件培养基无法加速内皮细胞的迁移和血管形成能力；然而，在对照组中观察到了显著的促进作用。综上所述，这些结果支持了EGR1在UM中作为促血管生成的重要促进因子的事实。为了进一步验证EGR1在nPD-L1介导的促血管生成中的作用，将EGR1重新引入PD-L1沉默细胞中。

a-f.HUVEC迁移，血管形成和CAM实验显示，恢复EGR1在很大程度上挽救了PD-L1沉默细胞的促血管生成能力。

g-l.接下来，在正位移异种移植实验中，观察到EGR1的恢复使PD-L1沉默肿瘤中抑制的肿瘤生长和血管生成得到了挽救，明确地证明了EGR1作为nPD-L1促血管生成功能的必要调节因子。此外，将VEGFA重新引入PD-L1沉默细胞中。HUVEC迁移和血管形成实验证明，VEGFA的恢复在很大程度上挽救了PD-L1沉默细胞的促血管生成能力，这与EGR1的异位表达一致。因此，这些数据进一步表明nPD-L1通过激活EGR1/VEGFA信号通路来促进血管生成。由于抗VEGF治疗是多种癌症的重要治疗方法之一，进一步检测了抗VEGF治疗在UM中的治疗效果。正如预期的那样，当每周两次使用5mg/kg的剂量时，抗VEGF治疗显著抑制了肿瘤生长。值得注意的是，在PD-L1-UM细胞中，尽管抗VEGF仍然在体内显著减少了肿瘤生长，但与对照组相比，其疗效大大降低。这个结果与观察到的EGR1/VEGFA作为nPD-L1的下游因子一致，并进一步强调了促血管生成功能在nPD-L1介导的肿瘤生长中的必要性。

m–o.重要的是，在TCGA UM队列中，发现PD-L1与EGR1（R=0.27，P=0.018），PD-L1与VEGFA（R=0.31，P=0.0063）以及EGR1与VEGFA（R=0.44，P=5.2e–05）之间存在正相关的表达关系。

p-q.与PD-L1一致，较高的EGR1或VEGFA表达水平与UM的不良预后相关。r.因此，这些数据表明，nPD-L1通过EGR1依赖的方式促进血管生成在UM的进展中起到重要作用。由于A375细胞特异性表达PD-L1的明显膜信号，随后使用A375细胞作为对照，探究膜PD-L1在血管生成中的作用。相反，并没有发现PD-L1沉默导致A375细胞中EGR1或VEGFA表达显著降低。此外，PD-L1沉默并未削弱HUVEC的迁移和血管形成能力。此外，在TCGA-SKCM队列中没有观察到PD-L1与EGR1或PD-L1与VEGFA之间的显著相关性。这些结果表明膜PD-L1未能促进血管生成。

图5

要点5：

通过前期研究发现，磷酸化STAT3（p-STAT3）和nPD-L1在转录活化中起到共同的作用，进一步探究p-STAT3是否参与nPD-L1介导的EGR1转录激活过程。

a.首先，根据p-STAT3 CUT&Tag数据显示，PD-L1缺陷细胞中p-STAT3的全基因组结合强度明显降低（存储在GEO数据库中：GSE202883），这与之前观察到的p-STAT3作为nPD-L1在转录激活中的共激活因子一致。值得注意的是，p-STAT3结合位点的改变与多个致癌途径相关，表明PD-L1介导的p-STAT3调控在调节UM中起到重要作用。

b.发现p-STAT3在EGR1启动子区域富集明显增加，并且在PD-L1沉默后观察到信号的减弱。

c，d.通过染色质免疫沉淀验证，观察到p-STAT3结合到EGR1启动子的强度在PD-L1沉默细胞中降低，证明p-STAT3结合需要位于EGR1启动子的nPD-L1。

e.通过转染两个独立的shRNA沉默STAT3，并观察到STAT3的mRNA和蛋白水平均显著降低。

f–h.值得注意的是，STAT3沉默导致EGR1和VEGFA mRNA表达的显著降低。相应地，STAT3缺陷细胞与对照组相比，在促进HUVEC迁移和血管形成能力方面显著降低。

i–k.此外，在TCGA队列中，STAT3的表达水平与CD274（R=0.58，P=1.6^e–08）、EGR1（R=0.4，P=0.00026）和VEGFA（R=0.44，P=5.8e–05）在临床UM样本中的表达呈正相关，这支持了STAT3介导的EGR1转录激活的结论。

l.此外，STAT3表达水平的升高与UM患者的预后较差相关。

m.揭示了nPD-L1增强了p-STAT3与EGR1启动子的结合，从而促进EGR1的表达。

图6

要点6：

a.探究了PD-L1在UM中的核转位机制。由于HDAC2介导的PD-L1去乙酰化（在Lys263位点）促进了其核转位，而EP300诱导的PD-L1乙酰化可以挽救其核转位，测试了异常乙酰化水平是否导致nPD-L1的形成。值得注意的是，核-PD-L1⁺细胞与核-PD-L1^-细胞相比，PD-L1的乙酰化水平降低。

b.同时还观察到这些核-PD-L1⁺细胞中HDAC2水平显著增加，而EP300表达保持不变。c.这些数据表明，PD-L1的乙酰化水平与其核信号呈负相关。与之前的研究一致，发现EP300缺陷细胞的PD-L1乙酰化水平降低，而经过HDAC2抑制剂（santacruzamate A）处理后，细胞的PD-L1乙酰化水平升高。

d-f.值得注意的是，观察到EP300沉默促进了PD-L1的核转位，从而增加了PD-L1与EGR1启动子的结合。

g.与这些观察一致，EP300缺陷细胞中EGR1和VEGFA的水平升高。h-j.相反，当细胞经过HDAC2i处理时，PD-L1的核含量降低，导致PD-L1与EGR1启动子的结合受阻。

k.因此，经过HDAC2i处理后，EGR1和VEGFA的水平降低。治疗方面，HDAC2抑制剂抑制了UM细胞的促血管生成潜能，无论是HUVEC的迁移能力还是血管形成能力。此外，在TCGA-UM队列中，HDAC2与PD-L1（R=0.36，P=0.0013）、HDAC2与EGR1（R=0.27，P=0.015）以及HDAC2与VEGFA（R=0.51，P=1.5e–06）之间存在正相关关系。这些数据表明HDAC2介导的去乙酰化促进了nPD-L1的形成，从而促进了UM细胞的血管生成。l–o.为了进一步验证PD-L1乙酰化在其核转位中的作用，将野生型PD-L1（PD-L1^WT）和乙酰化缺陷突变体PD-L1^K263R重新引入PD-L1沉默细胞。值得注意的是，与PD-L1^WT相比，PD-L1^K263R显示出升高的核含量。p.此外，重新引入PD-L1^K263R后，EGR1和VEGFA的水平显著增加，而外源性PD-L1^WT则没有这种效应。

图7

要点7：

a-f.此外，正位异种移植实验证实，与PD-L1^WT相比，PD-L1^K263R显示出增强促进肿瘤生长和血管生成能力。综上所述，这些数据表明，动态的PD-L1乙酰化在癌症发生过程中作为血管生成的重要调节因子。为了进一步确认PD-L1（K263Q）乙酰化模拟突变体在PD-L1定位和血管生成中的作用，将PD-L1^WT和PD-L1^K263Q重新引入PD-L1敲除细胞。然而，通过免疫印迹和免疫荧光染色检测核/细胞质分离的蛋白水平，观察到PD-L1^K263Q的核含量与PD-L1^WT相比没有显著变化。重要的是，重新引入PD-L1^K263Q后，EGR1和VEGFA的水平保持不变。这些数据表明这种突变体无法模拟在我们的实验系统中过度乙酰化的PD-L1。由于HDAC2去除PD-L1的乙酰化修饰并促进其核转运，接下来测试了野生型PD-L1及其乙酰化缺陷突变体（PD-L1^K263R）对HDAC2抑制的响应。

g–l.与PD-L1^WT组相比，PD-L1^K263R对HDAC2抑制更具抵抗力，具有增强促进肿瘤生长和血管形成能力。这一结果进一步证明了HDAC2介导的Lys263去乙酰化在nPD-L1介导的血管生成中的重要作用。

图8

要点8：

a.与之前的nPD-L1研究相似，发现PD-L1敲除的乳腺癌细胞的EGR1和VEGFA的mRNA水平降低。

b.观察到乳腺癌细胞的EGR1启动子区域存在明显的PD-L1信号。

c.发现PD-L1缺陷的乳腺癌细胞（MDA-MB-231和MDA-MB-436）的EGR1和VEGFA水平降低。

d-g.进一步的功能实验证明，PD-L1缺陷的乳腺癌细胞在促进HUVEC迁移和血管形成的能力方面受到了削弱。此外，将PD-L1^WT和PD-L1^K263R重新引入PD-L1沉默的乳腺癌细胞（MDA-MB-231）。值得注意的是，与外源性PD-L1^WT相比，重新引入PD-L1^K263R后，EGR1和VEGFA的水平升高。此外，HUVEC迁移和血管形成实验显示，与PD-L1^WT相比，PD-L1^K263R具有增强的促进血管生成能力。这些数据表明，依赖于去乙酰化的核转位的PD-L1的促血管生成效应可能也适用于多种肿瘤，这需要未来进一步验证。PD1/PD-L1免疫治疗的出现极大地改善了皮肤切除性黑色素瘤和粘膜黑色素瘤的治疗方案。然而，尽管UM存在相当数量的PD-L1阳性病例，但其对抗PD1/PD-L1免疫治疗的反应差的具体机制仍然不清楚。在这里，证明UM表现出升高的核PD-L1水平，与SKCM和粘膜黑色素瘤中PD-L1的分布模式显著不同。

h.值得注意的是，HDAC2依赖的去乙酰化促进了核PD-L1的分布，进一步通过将p-STAT3招募到靶位点并激活EGR1表达来促进血管生成。

本文小结：

综上所述，本研究揭示了PD-1/PD-L1阻断在UM中疗效不佳的谜团。建立了血管生成和免疫抑制之间的联系，为肿瘤发生中PD-L1调控提供了新的理解。鉴于HDAC2介导的PD-L1去乙酰化增强了其核转位，UM患者可能会从PD-1/PD-L1阻断和HDAC抑制剂联合治疗中受益。

参考文献：

Yu, J., Zhuang, A., Gu, X. et al. Nuclear PD-L1 promotes EGR1-mediated angiogenesis and accelerates tumorigenesis. Cell Discov 9, 33 (2023). https://doi.org/10.1038/s41421-023-00521-7