IF 3.811，Viruses|细胞外囊泡释放无包膜禽呼肠孤病毒具有高度传染性前言： 2023年7月23日由海德研究院技术创新中心分子病毒学与免疫学实验室等团队研究人员在《Viruses》杂志上在线发表了题为“Nonenveloped Avian Reoviruses Released with Small Extracellular Vesicles Are Highly Infectious”的研究性论文。该研究表明，EVs和促聚变性FAST-EVs可能有助于ARV的毒力。
背景介绍： 囊泡包膜病毒是最近发现的一种非包膜病毒的替代形式，它可以避免免疫检测并可能增加全身传播。禽呼肠孤病毒(Avian Orthoreoviruses，ARVs)是引起鸟类和家禽各种疾病的主要原因。然而，抗逆转录病毒药物是否使用细胞囊泡运输途径进行外排和细胞间传播仍然知之甚少。通过透射电镜观察，证明了融合性arv感染的鹌鹑细胞产生了小的(直径约100nm)细胞外囊泡(ev)，其中含有电子致密物质。冷冻电镜扫描显示，这些囊泡不含ARV病毒粒子或核心颗粒，但OptiPrep梯度的EV部分确实含有从细胞释放的少量ARV病毒粒子。用Western blotting检测经洗涤剂处理的EVs，发现EVs中含有可溶性病毒蛋白和促聚变p10 FAST蛋白。值得注意的是，与EV混合的病毒颗粒的传染性比单独的病毒粒子高50倍。这些结果表明，EVs和促聚变性FAST-EVs可能有助于ARV的毒力。 图文解析：
图1 要点1： A.最初的目标是确定ARV p10整合膜蛋白是否在外泌体中释放。为此，用ARV 176株感染鹌鹑(QM5)细胞，并使用差速和浮力密度离心法分离小EVs。 B.结果显示，感染ARV的QM5细胞在感染后16h开始相互融合，合胞体随着时间的推移逐渐扩大。40h时，培养皿中大部分细胞融合在一起。 C.在感染后的不同时间点(16,20,24,28,40h)，从病毒感染细胞的上清中收集EV，通过差速离心法并在100,000×g下离心最终获得p100分数。用Triton X-100处理24h后的细胞，超声破膜，100,000×g重造粒，通过免疫印迹分析p100。免疫印迹数据显示，大部分跨膜蛋白p10被释放到上清中，表明在处理下，EV膜和p10被溶解，反过来表明ARV FAST蛋白在EV中被释放。用鸡抗血清对三种主要结构蛋白λA、µB和σB进行免疫印迹分析，结果显示，这些主要的蛋白大部分存在于超声处理后的颗粒中，这意味着它们存在于病毒粒子中。这表明p100组分中同时存在病毒粒子和EV。 D.此外，用ELISA法检测感染后24h和28h的ARV感染细胞p100片段中蛋白σB(代表完整的病毒颗粒)的存在，用1% Triton X-100破坏EV膜时，蛋白σB的含量明显增加。 E.使用OptiPrep浮力密度梯度对p100颗粒进行进一步分离，并进行Western blotting分析。使用EV标记物Tsg101和Hsp70进行免疫印迹鉴定，这些片段也含有ARV p10 FAST蛋白。这些结果暗示这种非结构病毒蛋白被释放作为EV的整体膜蛋白。正如预期的那样，在最致密的Optiprep低组分中观察到主要的ARV蛋白σB的存在，对应1.2462gm/mL的密度，其中完整的病毒粒子成球(ARV病毒粒子的密度约为1.36g/cm3)。然而，在密度较低的上部分数中也大量检测到σB，并延伸到EV中。 F.有趣的是，当在感染后24小时收集EV，并汇集然后加入到未感染的QM5细胞中时，发生了广泛的合胞体形成，类似于用OptiPrep梯度的高密度ARV病毒颗粒处理细胞时所观察到的情况。这些结果表明EV组分中含有感染性物质。
图2 要点2： A.应用电镜技术对病毒囊泡进行了观察，以探讨病毒传染性的基础。透射电镜图像显示，EVs中的电子密度中心与呼肠孤病毒粒子大小相当，并且似乎包含与呼肠孤病毒粒子相似的角状结构。然而，来自未感染细胞的EV显示出类似的密度。为了最终确定EV分数的感染性是否反映了囊泡包膜病毒粒子的存在，用冷冻电子显微镜断层扫描分析了EV分数。 B.大多数100nm的EV含有不规则形状的包涵体，但这些包涵体显然不是呼肠孤病毒。冷冻电镜断层扫描也显示游离病毒颗粒未被包裹在囊泡内。为了进一步表征EV的性质以及它们如何促进ARV的感染性，通过将含有EV的OptiPrep组分或单独含有病毒粒子的OptiPrep组分应用于未感染的QM5细胞，确定了它们的相对感染性。 C.为了标准化病毒接种，基于主要外衣壳蛋白µB对EV和病毒粒子组分进行归一化，通过连续稀释定量，通过Western blotting获得线性检测范围。用标准化的接种剂处理QM5细胞，在EV或病毒颗粒处理后的早期(4h)和中期(18h)收获细胞。使用S3 dsRNA基因组片段负链特异性引物，采用qRT-PCR定量测定两种处理的相对传染性，表明子代病毒基因组复制的数量。 D.在四个独立的实验中，在感染后4小时，这是病毒基因组复制发生的有限时间，相对于病毒粒子部分，EV部分的传染性只有适度的增加(1.6±0.3倍)。然而，在感染后18小时，当子代病毒基因组复制顺利进行，但在继发性感染建立之前，EV分数对病毒粒子分数的感染倍数在9.7-47倍(26.9±18.9倍)之间。游离病毒蛋白或基因可能存在于EVs中，除了存在于这些部分中的囊外病毒粒子;因此，仅检测病毒蛋白来校准病毒接种的含量可能会使结果产生偏差。因此，使用qRT-PCR对EV和病毒粒子接种物的基因组等效物进行标准化，从而验证了用µB标准化接种物获得的结果。在这些实验中，还通过空斑法直接评估了EV和病毒粒子组分的相对感染性。结果显示，EV的传染性明显高于病毒粒子部分。在四个独立的实验中，当基于病毒基因组归一化病毒粒子数量并使用空斑测定法量化感染性时，EV组分的传染性相对于病毒粒子组分增加了33-50.8倍(40.7±9.9倍)。
图3 要点3： A.在用Western blotting分析病毒粒子和EV组分时，注意到主要衣壳蛋白的相对比例存在差异。鸡抗血清从病毒感染的禽类中获得，可识别主要的核心(λA)和外衣壳(σB,µB)结构蛋白，包括次要的σC刺突蛋白。 B.通过三个独立实验对病毒粒子和EV组分进行连续稀释，定量分析了σB和λA蛋白的条带强度，结果表明EV组分中含有较少的σB外衣壳蛋白相对于λA核心蛋白。对于µB蛋白，这在视觉上也很明显。核心蛋白比例是正呼肠孤病毒核心颗粒的预期蛋白谱，它缺乏所有三种外衣壳蛋白。还注意到，与鸡抗ARV血清反应的EV中存在的一种蛋白的可检测水平有所增加，该蛋白的迁移速度略快于σB蛋白，σC刺突蛋白迁移的位置。对SDS-PAGE凝胶中的该区域进行质谱分析，结果表明该波段含有σC蛋白。σC蛋白以三聚体形式存在，尽管并非所有顶点都有σC三聚体，这意味着在ARV病毒粒子中只有36个或更少的σC拷贝。蛋白质负载下用于Western blotting检测不到在病毒粒子中部分蛋白，虽然不同实验之间的水平不同，但在EV部分中总是可以检测到σC波段，并且经常是一个突出的波段。 C-E.在Triton X-100增溶和再离心EV和病毒粒子，还分析了蛋白质谱。如图3D,E所示，洗涤剂处理后得到了等效的σB外衣壳和λA核心蛋白的比例。这些结果表明，在EV片段中可能存在可溶性λA蛋白(即，洗涤剂去除可溶性λA蛋白后，剩余的病毒蛋白全部留在病毒粒子中，而不在核心颗粒中)。相比之下，EV馏分中多余的σC峰蛋白很大程度上抵抗洗涤剂萃取。在Triton处理的p100样品中也观察到同样的现象。得出结论，除了p10 FAST蛋白可能嵌入EV膜外，EV还含有可溶性λA蛋白和不溶性σC刺突蛋白。这些病毒蛋白是否有助于从arv感染细胞中释放的ev增强感染特性仍有待确定。 本文小结： 综上所述，ARV感染的鹌鹑细胞释放了大量的病毒粒子，其中一些病毒粒子共同沉积在OptiPrep梯度组分中，这些梯度组分含有100nm直径的EV。低温层析成像和Western blotting最终表明，这些EV不包裹ARV病毒粒子或核心，但它们确实含有p10整合膜蛋白，并且似乎包裹了两种病毒结构蛋白，即主要核心蛋白和病毒细胞附着蛋白。最值得注意的是，观察到，病毒粒子加EVs的传染性可能比单独的病毒粒子高50倍。 参考文献： Wang Z、He M、He H.et al.Nonenveloped Avian Reoviruses Released with Small Extracellular Vesicles Are Highly Infectious.Viruses.2023 Jul 23;15(7):1610. https://doi.org/10.3390/v15071610 |
