IF 16.6 ，Nature Communications│递送干细胞外泌体的多孔微针贴片修复急性脊髓损伤

前言：

2023年7月7日，浙江大学王绪化团队在Nature Communications发表题为“Porous microneedle patch with sustained delivery of extracellular vesicles mitigates severe spinal cord injury”的研究论文，研究人员提出了一种用于细胞外囊泡输送治疗脊髓损伤的装置。结合间充质干细胞和多孔微针的装置能够递送细胞外囊泡。证明局部应用于脊髓病变下硬脑膜，不损害病变。在挫伤性脊髓损伤模型中评估了装置的疗效，发现它减少了空腔和疤痕组织的形成，促进了血管生成，提高了附近组织和轴突的存活率。重要的是，细胞外囊泡的持续递送至少7天会导致显著的功能恢复。

研究背景：

每年大约有93万例由事故引起的新脊髓损伤（SCI）病例。脊髓损伤最初是由机械性创伤和炎症反应后继发损伤的多种机制引起的。继发性损伤可引起出血、水肿、血流量减少和炎症，从而影响邻近的脊髓节段。由小胶质细胞的激活和促炎细胞因子的释放引发的炎症环境导致不可避免的神经元损伤，从而在脊髓病变部位形成疤痕和囊腔。最近，大量研究表明，静脉注射间充质干细胞(MSCs)可促进SCI挫伤后的功能恢复。然而，肺有能力清除超过60%的给药间充质干细胞（MSCs），导致能够从病变部位转移到受伤部位并发挥治疗作用的间充质干细胞数量减少。尽管肺中的一些细胞可能存活2-3天，并释放可能到达目标损伤部位的外泌体，但患者可能会出现咳嗽副作用。另外，MSCs直接移植到病变部位被认为是缓解SCI引发的神经炎症的有效治疗方法。然而，脊髓损伤(SCI)病变的神经炎症微环境不利于间充质干细胞(MSCs)的存活和功能，因此对这些细胞的临床应用构成了重大障碍。

图文解析：

图1

要点1：

研究人员利用微针(MN)阵列，在临床试验中促进了药物或治疗性生物分子的无痛局部递送，具有良好的耐受性。然后，制作一个带有MN阵列的贴片，该贴片具有与软脊髓组织相匹配的适当机械强度，并且当将其安装在硬脊膜下的脊髓病变上时，具有适合MSC-EV递送的合适孔径。为了可持续地递送MSC-EV, MN阵列在手术过程中额外安装了嵌入MSCs的明胶甲基丙烯酰(GelMA)水凝胶块。我们设想GelMA水凝胶块可以提供生物相容性微环境，促进MSCs的长期存活。通过这种方式，通过使用多孔MNs实现了骨髓间充质干细胞分泌组向脊髓病变的持续递送。提出了这种方法来提高治疗效果,而无需直接入侵的MSC脊髓。研究发现MN-MSC可以有效地保持MSC的生存和可持续释放检查参与组成分泌腺MSC至少一个星期,导致显著的神经保护作用,优越的肌肉控制,功能强劲复苏后严重SCI。

图2

要点2：

a.使用骨髓为了实现MSC分泌组的可持续释放，研究人员设计了一个含有MN阵列的贴片。MN贴片由化学交联的甲基丙烯酰(MW)(250kDa)用微成型方法形成GelMA。制备的MN贴片的尺寸约为4mm×4mm，共45根针，足以覆盖典型的大鼠脊髓挫伤病变。

e-g.MN阵列的针状结构为锥形，基部直径为250μm，高度为600μm，针尖直径为10μm。为了持续释放细胞外囊泡，在手术期间，贴片还覆盖了嵌入MSCs的GelMA水凝胶。设计了具有多孔结构的凝胶，以促进MSC-EV通过聚合物针的释放。

b.扫描电镜(SEM)图像显示，凝胶的孔径达到约100μm，而传统的GelMA水凝胶的孔径相对较小，只有10μm。为了检测MN贴片的生物相容性，首先将含有MSCs的甲基丙烯酰溶液(40μl，约2.5×10⁷个细胞/mL)滴在贴片表面，并在蓝光照射下与甲基丙烯酰交联形成GelMA水凝胶。

c.GelMA水凝胶的活/死染色显示，在培养3天和5天后，嵌入的MSCs具有良好的活力。

d.CCK-8测试的定量分析表明，MN-MSC贴片的GelMA水凝胶中的MSCs存活并增殖良好。

h-i.评估这种多孔结构的MN贴片的MSC-EV释放能力。为此，将多孔GelMA26或常规GelMA制成的贴片植入MSCs，并放置在Transwell的上部隔室中。然后将Transwells浸入培养基中，在37°C下孵育。每隔一段时间，从底孔中抽取等量样品，

j.用Micro-BCA Protein Assay kit检测样品中MSC-secretomes的浓度。从样品的光密度(OD)图可以看出，由多孔GelMA制成的MN贴片更有效地释放MSC-分泌组，可能是因为孔径较大的MN贴片对MSC-分泌组更具渗透性。因此，选择了由多孔GelMA制成的MN贴片进行后续研究。

k.绘制了Transwell系统下部井在不同时间点采集的样品中释放的MSC-EV数量。结果表明，装载MSC-EV的MN贴片的MSC-EV释放在最初的4天内迅速下降，而来自MSC的MN贴片的MSC-EV释放保持稳定，在2周时略有增加。这表明MN贴片具有良好的生物相容性，允许间充质干细胞存活。因此，成功地制造了一种持续高效递送MSC-EV的装置。

图3

要点3：

a.将MN贴片置于脊髓病变上方，将混合MSC-EV的GelMA溶液置于MN贴片上方，进行蓝光光固化处理。

b-c.手术后7天，发现大多数释放的MSC-EV都定位并聚集在脊髓损伤部位，表明MN贴片的局部递送能力。

d.从苏木精和伊红染色的脊髓切片图像(H&E)可以看出，此时MN斑块仍然存在于脊髓表面。

e-f.更重要的是，脊髓组织中人间充质干细胞标记物GAPDH的染色表明，脊髓损伤后第7天，骨髓间充质干细胞在MN-MSC中存活良好。这些结果证实，MN-MSC中的MSCs可以在损伤部位存活足够长的时间，以覆盖脊髓损伤的最佳治疗时间窗。此外，从脊髓边界到中心的连续脊髓切片的免疫荧光染色显示，MN-MSC贴片中的MSCs没有从GelMA水凝胶块迁移到脊髓中。结果表明，制备的装置成功地维持了MSC的活力，这可能使MSC-EV持续释放至少一周，而不会使MSC侵入脊髓。

图4

要点4：

a-b.为了评估MN-MSC贴片是否能改善SCI诱导的神经炎症环境，构建了未经任何处理的动物模型(对照组)、单独MN贴片植入(MN组)、单独EV凝胶植入(Gel - EV组)、单独MSC凝胶植入(Gel-MSC组)、MN贴片植入MSC-EV (MN-EV组)或MN贴片植入MSC (MN-MSC组)进行比较。移植后7天，

c-e.采用Western blotting方法检测不同处理大鼠脊髓病变脊髓组织的蛋白表达水平。在MN-MSC贴片处理的大鼠脊髓组织中，观察到促炎标志物IL-1β和TNF-α的表达显著降低，抗炎标志物TGF-β和Arg-2的表达增加。此外，促凋亡标志物BAX和炎症标志物MMP-9的表达显著降低。

f-h.实验表明，与对照组相比，MN单独在减少过量的TNF-α和MMP-9表达方面表现出一定的作用，主要由M1巨噬细胞控制。所有MN贴片治疗组都表现出TNF-α和BAX表达下降，表明炎症受到抑制。然而，只有MN-MSC治疗组抗炎细胞因子TGF-β升高，精氨酸酶-2升高，IL-1β表达降低，均有统计学意义。这些发现表明，观察到的有益效果可能部分归因于MN贴片本身的生理反应。

图5

要点5：

a.IL-4为了确定MN-MSC贴片处理后是否有更多下行轴突存活，在前2周将AAV2/9-hSyn-mCherry注射到6组大鼠的T7-T8区，以追踪下行的本体脊髓轴突。

b-d.用红色荧光蛋白(RFP)抗体对脊髓切片进行染色后，发现不同治疗组损伤部位上方RFP⁺轴突数量无显著差异。然而，与其他组相比，MN-MSC组大鼠在损伤水平以下的RFP⁺本体脊髓轴突数量更高。然后分别用抗5-羟色胺和抗神经丝(NF)染色脊髓切片的5-羟色胺能轴突和轴突纤维。发现5-HT和NF染色结果与RFP染色的趋势相似。六组损伤部位上方NF和5-HT无明显差异。

e.相比之下，MN-MSC组大鼠在损伤部位下方有更多的5-羟色胺能轴突(5-HT染色)和轴突纤维(NF染色)，表明MN-MSC贴片治疗的脊髓损伤后更多的本体脊髓轴突存活。与其他组相比，发现在接受MN-MSC治疗的受试者中，更多的轴突延伸到脊髓损伤部位，这表明MN-MSC贴片治疗持续输送EV的微环境更有利于轴突的再生。此外，没有观察到对照组和MN组在保护未受损轴突免受继发性损伤方面有任何显著差异。这些结果表明，微针阵列本身对轴突保护没有任何影响。

f-h.有趣的是，与对照组、MN、Gel-EV处理相比，确实观察到Gel-MSC和Gel-EV处理的大鼠损伤下存在更多的5-HT轴突，表明这些治疗显示出一些尽管有限的神经保护作用。值得注意的是，与其他组相比，观察到MN-MSC组位于损伤部位下方的轴突数量显著增加。

图6

要点6：

a-b.双盲方法及BBB 评分法对大鼠后肢功能进行分析。发现其他组大鼠在观察期间出现瘫痪，偶有踝关节活动，平均BBB评分小于4。尽管MN-MSC组的大鼠在前3周主要表现为后肢瘫痪，与其他组没有显著差异，但在第4周时，它们表现出有力的膝关节和踝关节运动。损伤后4周，各组大鼠BBB评分明显高于其他各组大鼠。

c-d.更引人注目的是，在脊髓损伤后第8周，接受MN-MSC贴片治疗的大鼠后肢运动功能得到改善，体重支撑和步长均高于其他组。值得注意的是，发现MN- MSC贴片处理组的11只大鼠中有4只表现出持续的后肢足底支撑，BBB评分达到10分以上，而其他各组大鼠均未出现这种情况。

e-g.此外，通过对对照组、MN、Gel-EV、Gel-MSC、MN-EV、MN-MSC和完整组大鼠7种后肢运动学的分析，发现MN-MSC贴片处理可以增加髂骨和趾的最大高度;髂骨和趾的高度振幅;

h-k.有趣的是，观察到与对照组相比，MN、Gel-EV、Gel-MSC和Gel-EV治疗的大鼠步幅增加，这表明MN有限的神经保护作用也可能有助于它们适度恢复。同时，Gel-EV、Gel-MSC和Gel-EV组髋关节、膝关节和踝关节的角度振荡均大于MN组，与MN-MSC组相当。l.然而，经MN-MSC贴片处理的大鼠后肢运动能力明显好于其他各组，但不如完整组大鼠，这表明这种治疗的后肢功能恢复依赖于病变处残余的脊髓连接。虽然各组的所有指标均除以完整组的对应指标，但很明显，MN-MSC组大鼠的嵴和趾的振幅与其他治疗组大鼠相比相当高。

m.然而，MN-MSC处理大鼠的趾和嵴的最大高度明显高于其他组，可能是因为趾和趾决定了行走时的步态和步幅。综合考虑各组的数值和分布，发现MN-MSC组大鼠脚踝、膝盖和脚趾的角度振幅变化最小。这与后肢运动学分析结果一致。

图7

要点7：

a-c.为了进一步确定MN-MSC贴片治疗的作用机制，对麻醉期间的大鼠进行了体感诱发电位(SSEP)监测研究。与BBB评分相比，SSEP更直接地测量皮层投影神经通路的功能。

f.正如预期的那样，发现SSEP在损伤后第8周表现出与BBB评分相似的趋势，这证实了MN-MSC贴片治疗的轴突保护能力。

d-h.然后，记录肌电图(EMG)数据来评估大鼠在行走时的后肢肌肉运动。发现对照组大鼠胫前肌(TA)和腓肠肌比目鱼肌伸肌(GS)的踝关节屈肌信号很少活跃，其他治疗组的肌肉信号只能偶尔观察到。相比之下，MN-MSC贴片处理的大鼠在不同步骤中可以一致地观察到TA和GS的交替激活。为了进一步分析肌电数据，采用Poincaré统计分析来分析TA和GS肌肉的节律。发现MN-MSC组大鼠的TA和GS肌肉节律比其他组大鼠更有规律，散点分布范围更广，更集中在中心点(零)位置，与完整组更相似，表明MN-MSC贴片治疗后大鼠的肌肉得到了更好的控制。由此，研究人员探讨了为什么MN-MSC贴片处理的大鼠的步态比其他大鼠的步态更接近正常。这些结果表明，在MN-MSC贴片治疗条件下，运动功能的改善是由轴突修复介导的。

本文小结：

综上所述，在这项研究中，构建了一种先进的MN-MSC贴片，可以提供MSC-EV从嵌入的贴片持续递送到损伤部位的脊髓组织，并避免了干细胞直接侵入脊髓的风险。该贴片的MN组分由具有良好生物相容性的多孔GelMA水凝胶制成，贴片可以长时间停留在脊髓病变的顶部，从而达到最佳的治疗窗口，实现了MSC-EV治疗的最大疗效。

参考文献：

Fang, A., Wang, Y., Guan, N. et al. Porous microneedle patch with sustained delivery of extracellular vesicles mitigates severe spinal cord injury. Nat Commun 14, 4011 (2023).

网址：https://doi.org/10.1038/s41467-023-39745-2