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IF 15.6 J Exp Med│澳门大学路嘉宏等团队合作揭示通过偏向性FPR2信号增强胞葬作用可减轻肠道炎症

IF 15.6 J Exp Med│澳门大学路嘉宏等团队合作揭示通过偏向性FPR2信号增强胞葬作用可减轻肠道炎症

前言

2023年12月22日,澳门大学路嘉宏、香港中文大学叶德全共同通讯在EMBO Molecular Medicine上在线发表题为“Enhancement of efferocytosis through biased FPR2 signaling attenuates intestinal inflammation”的研究论文,该研究报道了非洲防己(columbamine,COL)的鉴定,它可以增强巨噬细胞介导的胞葬作用,并减轻小鼠结肠炎模型中的肠道炎症。COL通过促进LC3相关的吞噬作用(LAP)增强胞葬作用,LAP是自噬的一种非标准形式。

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背景介绍

成年人每天大约会产生200-300亿个死亡细胞,由于被称为胞葬作用的高效死细胞清除过程,死细胞被迅速清除,并且在组织中很少可见。死亡细胞释放包括DNA和ATP在内的损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs),如果不能被有效清除,将触发天然免疫反应;因此,胞葬作用是一种内在的抗炎机制。最近的研究表明,胞葬作用通过诱导吞噬细胞的代谢重编程来主动抑制炎症。胞葬作用的损伤与多种疾病有关,包括自身免疫性疾病、动脉粥样硬化、癌症和感染等。对胞葬作用的调节可能为这些疾病的治疗干预提供新的机会。炎症性肠病(IBD)是一种慢性复发和缓解的肠道炎症性疾病,可分为克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)两种类型。先前的研究表明,胞葬作用介导了结肠的炎症反应和组织修复。在实验性结肠炎模型中,LSECtin(Clec4g)依赖的巨噬细胞尸体清除缺陷和NRBF2介导的胞葬作用缺失导致严重的上皮损伤和炎症反应。此外,胞葬作用的遗传增强对肠道炎症具有保护作用。这些结果表明胞葬作用是肠道炎症消退的有效机制。

图文解析

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要点1A.研究人员通过将TNF-α诱导的凋亡胸腺细胞(CMFDA染色)与原代小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)孵育,并通过检测培养基中未吞噬的CMFDA衍生的荧光强度来分析胞葬能力,建立了一种筛选胞葬增强剂的体外实验方法。B.筛选了一个包含392个结构多样的天然化合物的库,鉴定了包括非洲防己硷(COL)在内的多个化合物,这些化合物可能具有加速胞葬作用。C-D.COL处理的BMDMs在孵育24 h后吞噬了比对照组更多的凋亡细胞(apoptosis cells,ACs),而没有表现出明显的毒性,表明吞噬能力增强。E.此外,COL处理的BMDMs与ACs共培养的延时成像显示出对ACs的快速识别,并在2h内吞噬更多的ACs。F-G.研究人员还发现BMDMs在COL浓度为10 nM时开始表现出增强的胞葬作用,并且在COL浓度为1 μM时显著增强体外胞葬作用。H-I.体内研究表明,COL给药加速了小鼠肝脏和脾脏中ACs的清除。总的来说,COL被鉴定为一种胞葬增强剂,在体外和体内刺激BMDMs摄取和降解ACs的能力。

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要点2A-B.AC与BMDMs共孵育诱导了LC3脂化的快速增加,LC3脂化是LC3膜招募的标志。结果表明,COL处理增强了AC诱导的LC3脂化。C.3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻断LAP可以抑制COL诱导的巨噬细胞ACs吞噬的促进作用。D-E.研究人员观察到在BMDMs中,COL处理快速而强烈地增强了GFP-LC3招募吞噬的ACs,而3-MA处理完全阻断了招募。F-H.有趣的是,研究人员发现COL诱导VPS34‐鲁比肯‐RAC1形成,而加入3‐MA可以完全阻断这一过程。I-J.同时,COL诱导的GFP‐LC3募集到吞噬体的增加可以被3‐MA阻断。这些结果表明,COL通过增强RAC1-RUBICON-VPS34相互作用诱导LAP相关的胞葬作用。

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要点3A-E.结果显示,COL给药缓解了DSS诱导的体重下降、结肠长度缩短以及疾病活动指数(DAI)、脾脏重量和MPO活性的增加。F-G.组织学检查显示,COL处理组的结肠组织形态总体改善。H-I.COL处理小鼠的结肠组织切片进行TUNEL染色,发现ACs的数量显著减少。这些结果表明,COL可以减轻DSS诱导的小鼠结肠炎和AC积累。

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要点4A.为了评估巨噬细胞是否为COL的抗结肠炎作用所必需,研究人员用含有氯膦酸二钠的脂质体(Clo‐Lipo DOTAP)清除巨噬细胞。B-C.DSS处理后,与对照相比,巨噬细胞缺失的小鼠显示出更低的脾脏和肝脏重量,这与之前的研究一致。D-F.研究结果表明,COL的抗结肠炎活性在很大程度上被消除了。G-H.此外,巨噬细胞剔除的小鼠在COL处理后没有显示出对结肠上皮破坏和炎症细胞浸润的减弱作用。这些结果表明巨噬细胞是COL缓解结肠炎损伤的靶细胞类型。

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要点5A.为了揭示COL如何作用于巨噬细胞,研究人员分析了COL处理的巨噬细胞的转录组数据。B.GO富集分析表明,COL增加了趋化性、受体结合、细胞外组织、NADH活性和G蛋白偶联受体(GPCR)结合相关基因的表达。C-G.研究人员发现FPR2是IBD患者外周血单个核细胞中唯一的差异表达基因,表明FPR2与IBD之间具有高度相关性。为了确认FPR2是否为COL诱导的生物学功能所必需,研究人员在加入COL之前用FPR2特异性拮抗剂WRW4肽预处理阻断FPR2信号传导。I-J.研究人员发现阻断FPR2可以在体外和体内阻止COL诱导的胞葬作用增强。这些结果验证了研究人员的假设,即FPR2对于COL诱导的胞葬作用是必需的。

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要点6A-B.WRW4处理得到的数据一致,在FPR2敲除的BMDMs)中,COL诱导的胞葬作用完全消失。C-E.在结肠炎模型中,FPR2-/-小鼠没有表现出明显的体重下降,但在DSS处理后,与野生型(WT)小鼠相比,FPR2-/-小鼠表现出更高的DAI,表明FPR2部分调节了DSS诱导的结肠炎发展,这与之前的报道一致。正如预期的那样,FPR2的缺失取消了COL在改善体重下降、DAI增加和结肠皱缩方面的抗结肠炎活性。F.然而,在FPR2-/-小鼠的炎性结肠组织中,MPO活性增加受到抑制,这可能是由于FPR2参与了趋化和中性粒细胞脱颗粒。G-H.此外,组织学分析表明,在FPR2-/-小鼠中,严重的DSS诱导的上皮层损伤和炎症细胞浸润不能被COL缓解。总的来说,这些数据表明FPR2是COL诱导的小鼠结肠炎缓解所必需的。

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要点7A.为了了解COL对FPR2信号的影响,研究人员仔细研究了FPR2下游的信号事件。令人惊讶的是,研究人员发现在小鼠和人FPR2过表达的RBL细胞中,COL不能直接触发钙离子动员,但COL预处理增强了W肽诱导的钙离子动员,这一作用被WRW4所阻断。B-D.研究人员还发现COL刺激了剂量依赖的cAMP反应(减少胞浆cAMP的积累),这是Gαi蛋白与FPR2偶联的功能,并且可以被WRW4抑制。E-H.在表达hFPR2的细胞中,研究人员发现10 μM的COL可以诱导β-抑制蛋白的膜招募,这表明COL与hFPR2之间存在相互作用。为了进一步验证COL是否是FPR2的配体,研究人员使用1 μM的COL刺激hFPR2,并观察到其内化现象。为了研究COL是否能够诱导传统的GPCR介导的磷酸化信号,研究人员在hFPR2-表达的RBL细胞中检测了磷酸化ERK1/2、p38、JNK、AKT和PKA的表达水平。J.然而,在COL刺激后,它们都没有表现出明显的磷酸化。

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要点8A.数据表明COL靶向并激活FPR2,但COL是否直接与FPR2结合尚不清楚。研究人员使用等温滴定量热法(ITC)来评估COL和FPR2之间的直接结合。25°C时,解离常数(Kd)为9.62 μM,结合化学计量(n)为1.38。B.WKYMVm深入插入FPR2跨膜螺旋束不同,COL与FPR2的结合相对较浅且横向,类似于脂氧素A4(LXA4),一种众所周知的抗炎FPR2配体。C.计算发现R205,D106和S288是潜在的COL‐FPR2结合位点,其中R205和D106已被鉴定为W‐pep结合,而S288是COL‐特异性结合位点,此前未被证明与W‐pep相互作用。D.这些结合位点与预测的LXA4-FPR2相互作用大致相同,其中D106,R205和S288也参与其中。E-F.CAMP反应实验用于功能测定。结果表明,R205A和S288A突变显著增加了COL的EC50,表明它们在介导COL活性中起关键作用。

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要点8:A-B.为了确定FPR2是否参与COL诱导的LAP,研究人员使用WRW4阻断FPR2信号通路。研究人员发现添加WRW4完全阻断了COL处理组增强的LAP。C-D.此外,WRW4处理消除了VPS34与RAC1或鲁比肯与RAC1之间的相互作用。E-G.研究人员发现COL增加PLCdelta‐PH‐标记的伪足动态活性,这种作用被WRW4阻断。H-I.此外,WRW4也阻断了COL处理后GFP-LC3向吞噬体募集的增强。总的来说,这些数据表明,FPR2通过促进RAC1激活和RAC1-RUBICON-VPS34相互作用,在COL诱导的LC3相关efferocytosis中是不可或缺的。


全文小结

综上所述,该研究报道了一种天然生物碱非洲防己碱(COL),作为LAP相关的胞葬增强因子,通过FPR2触发偏向性信号来减轻结肠炎症。这些发现揭示了FPR2在介导LC3相关的胞葬作用以减轻结肠炎症中的新作用,并提示COL作为FPR2的偏倚激动剂用于结肠炎治疗的治疗潜力。


参考文献:Wu MY, Ge YJ, Wang EJ, Liao QW, Ren ZY, Yu Y, Zhu G, Liu CP, Zhang MN, Su H, Shen HM, Chen Y, Wang L, Wang YT, Li M, Bian Z, Chai J, Ye RD, Lu JH. Enhancement of efferocytosis through biased FPR2 signaling attenuates intestinal inflammation. EMBO Mol Med. 2023 Dec 7;15(12):e17815. https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/emmm.202317815


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