IF 15.9 JCI|调节性T细胞黏附抑制树突状细胞功能的分子机制

IF 15.9 JCI|调节性T细胞黏附抑制树突状细胞功能的分子机制

前言

2023年12月15日，清华大学石彦团队在Journal of Clinical Investigation在线发表题为“Foxp3-mediated blockage of ryanodine receptor 2 underlies contact-based suppression by regulatory T cells”的研究论文，该研究表明Foxp3介导的ryanodine受体2的阻断是调节性T细胞接触抑制的基础。

背景介绍

Tregs的抑制机制仍然是一个持续争论的话题。提出的机制包括T细胞溶解、表面蛋白提取、局部生成腺苷等，都需要Treg结合到它们的抑制靶标上。近年来，一系列的报道将研究重点转移到直接抑制DCs上。这种关注有两个自然的理由。一方面，Tregs在数量上远远超过CD4⁺ T细胞，但它们对DCs保持着数量上的优势，在体内的比例大致为2：1，推断出更合乎逻辑、更明智地使用抑制能力。其次，DC/Treg的直接结合似乎在体内和体外都很常见。虽然这种绑定被认为是对DCs施加抑制，但对于确切的操作模式尚未达成共识。

图文解析

图1

要点1：A.由于m-calpain活性在Tregs中降低，分析其表达水平是否确实较低。Tconvs和Tregs在蛋白或mRNA水平上没有发现m-calpain的差异。钙蛋白酶受不同细胞内Ca²⁺可用性的调节。Tregs中总的Ca²⁺信号持续降低。B-C.为了详细研究这一点，用Fluo-4 AM和比例Cal Red R525/650AM两种不同的指标观察了静息状态下Tconvs和Tregs中的Ca²⁺信号。虽然自发的Ca²⁺振荡是许多免疫细胞(包括Tconvs)共有的共同特征，但这种活性在Tregs中基本不存在，这支持了它们的低m-calpain激活。D-E.这种激活诱导的信号在静息细胞中不存在。为了揭示为什么自发Ca²⁺振荡在Tregs中较低，使用实时定量PCR(qPCR)扫描了典型的钙调节因子，发现膜钙通道蛋白RyR2在Tregs中显示出显著降低的mRNA和蛋白水平。F.在KD检测中，Ryr2特异性shRNA降低了Ryr2 mRNA水平。这与处理后的Tconvs中自发Ca²⁺振荡的减少有关，与钙蛋白酶底物消化的减少一致。G.为了证实这种增加的结合排除了抗原特异性Tconvs与相同DC的结合，进行了细胞结合力分析。与Treg介导的阻断类似，正如之前报道的，Ryr2-KD Tconvs抑制了OT-II T细胞与ova负载DC之间的结合强度。H.在单细胞水平上证实，RyR2活性降低的Tconv在功能上等同于Treg，其阻断Tconv-DC相互作用的能力。shRNA处理的Tconvs也抑制了ova脉冲DC对OT-II T细胞分裂的反应，证实了RyR2的参与。

图2

要点2：A.为了确认RyR2在Tregs中的专一性，有必要确定其与Foxp3的联系。因此，在T、A20、3T3和Renca细胞中过表达Foxp3。在所有情况下，Foxp3的存在都降低了Ryr2 mRNA的水平，这表明Foxp3靶向Ryr2是自主的。B.使用IGV程序将该数据集中在Ryr2基因周围40kb区域时，在未转染的对照中检测到1.5kb启动子区域的信号。C-D.为了证实这种结合发生在原生状态，用WT Tregs进行了ChIP-qPCR分析。当这两个位点缺失时，Foxp3过表达失去了抑制荧光素酶的能力，表明Foxp3结合位点特异性。这些数据表明，Ryr2确实受到Foxp3的直接控制。

首先，我们将GLAST+CD133+细胞投影到统一流形近似和投影(UMAP)上，根据已发表的数据(GSE67833)可视化聚类(图2A)。这些NSCs被分成aNSCs和qNSCs, aNSCs高表达Egfr(已知的活性NSCs的标记物)

图3

要点3：A-B.Ryr2特异性缺失不会导致T细胞亚群的发育缺陷。这种缺失伴随着CD4⁺ T细胞中自发Ca²⁺振荡的减少。与未处理的Tconvs相比，Ryr2^-/- Tconvs的CMAC消化减少。B-C.同样，力谱显示Ryr2缺失后与DCs的结合增加。这伴随着它们在三细胞力分析中干扰DC与T细胞接触的能力增强。D.更重要的是，Ryr2^-/-   Tconvs在抑制抗原+DCs刺激的OT-II T细胞扩增方面的表现与Tregs相似。

图4

要点4：A-B.为了全面分析Ryr2缺失的影响，对静息状态和激活后的Tconvs、CKO Tconvs和Tregs进行了RNA-Seq和转座酶可及染色质测序(ATAC-Seq)分析。RNA-Seq显示，在Tregs和CKO细胞中RyR2的预期降低，CKO细胞中没有其他可疑的抑制功能显著升高。综上所述，在3种细胞类型中，激活与静止代表了一级(最大)差异。第二级差异是Tregs和Tconvs/CKO细胞之间的差异。最后一个顺序是在Tconvs和CKO细胞之间。因此，CKO细胞和Tconvs是相似的，它们与Tregs的距离都更远。ATAC-Seq结果显示了类似的趋势。

图5

要点5：

A.为了计算CKO细胞/Treg结合对DC与抗原特异性应答T细胞相互作用能力的影响，在对照Tconvs、Tregs或CKO Tconvs存在的情况下，向OT-II T细胞注入或不注入抗原。抗原增加了DC与应答的OT-II细胞之间的接触时间，无论DC是否与对照Tconv结合，都不会改变前者对的接触时间。然而，如果DC与Tregs或CKO细胞结合，DC应答者OT-II接触时间显著缩短。B.应答者OT-II细胞中的Ca²⁺报告活性将接触时间差异转化为T细胞激活强度。C-D.为了解决Treg/CKO细胞抗原特异性的问题，在持续存在OVA的情况下再次使用这种3细胞系统。在本系统中，OT-II Tregs和WT Tregs对DC/应答者OT-II细胞接触的阻断能力相同，CKO细胞和OT-II CKO细胞的结果相同，表明胸腺Tregs(tTregs)或CKO细胞的抗原特异性不影响其抑制效果。应答者OT-II T细胞中的Ca²⁺活性与这些数据一致。Tregs和CKO Tconvs本身的抗原特异性似乎不会改变它们抑制DC与其他T细胞结合的能力。

图6

要点6：A.在足底接种模型中，使用Treg或Ryr2^-/- Tconv处理时，HSV-1 pfu计数大约增加了1log。对照输注Tconvs与单独接种病毒相比没有增加。B-C.对于二次挑战，同样的模型已被用于证明延迟型超敏反应。致敏的足垫在第二次接种HSV-1时肿胀，Tregs和Ryr2^-/- Tconvs均能减少厚度的增加，而对照Tconvs则没有。在OVA致敏哮喘模型中，输注Tregs或Ryr2^-/- Tconvs在限制支气管肺泡灌洗液细胞计数方面同样有效，淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的减少程度相似。D-E.在MC38肿瘤模型中，输注Tregs和Ryr2^-/- Tconvs均促进肿瘤生长，而对照Tconvs无明显作用。因此，在几种已知Tregs具有免疫调节作用的疾病模型中，这些作用在缺乏Foxp3的情况下被Ryr2^-/-   Tconvs表型复制。缺乏功能性Tregs在foxp3缺陷(或安全)小鼠中最为明显，多器官自身免疫导致普遍炎症。这种病理导致在2-4周龄的限定窗口内死亡。如果Ryr2^-/- Tconvs的免疫调节作用在安全小鼠中代表了一种缺失的效应功能，那么Ryr2^-/- Tconvs应该在Foxp3系统缺失的情况下纠正这些自身免疫。安全小鼠(Foxp3^-/-，C57BL/6)在出生后2-3天注射PBS,Tregs,Foxp3^- Tconvs或Ryr2^-/- Tconvs。F-G.正如预期的那样，注射PBS或Foxp3^- Tconvs的小鼠在出生后2-4周内全部死亡。相比之下，所有注射Tregs或Ryr2^-/- Tconvs的小鼠存活超过1年，没有任何预期寿命缩短的迹象。对照组小鼠在第3周进行组织学分析，Treg0组和Ryr2^-/- Tconvv组小鼠在第8-12周进行组织学分析。正如预期的那样，PBS-或Foxp3-Tconvv输注小鼠表现出严重的甲状腺炎、脾炎、肺炎、皮炎、肝炎、胰腺炎、胃炎和结肠炎。H.输注Tregs或Ryr2^-/-   Tconvs均可阻止这些病理，这证明Ryr2的调节是Tregs的潜在的可推广效应机制。然而，应该认识到Ryr2^-/- Tconvs可能与Tregs有一些细微的差异;例如，在接受CKO细胞注入的小鼠中，获救小鼠的组织炎症评分略差。在上面讨论的哮喘模型中，通过减少细胞注入数量的滴定显示，Tregs在疾病控制方面比Ryr2^-/-   Tconvs更有效。Tregs的这种非力抑制的性质是未来研究的一个有趣的话题。

全文小结

综上所述，该研究揭示了Tregs的Foxp3介导的独特效应功能，并可能提供了之前难以捉摸的Tregs接触依赖性抑制的分子基础。

参考文献：Wang X, Geng S, Meng J, et al. Foxp3-mediated blockage of ryanodine receptor 2 underlies contact-based suppression by regulatory T cells[J]. The Journal of Clinical Investigation, 2023, 133(24).

https://www.jci.org/articles/view/163470