IF 17.521 ，Advanced Science│HSP90β阻碍STUB1介导的YTHDF2泛素化驱动肝细胞癌对索拉非尼的耐药性前言： 2023年7月28日，广州医科大学附属肿瘤医院黄宏标教授团队在Advanced Science发表研究论文“HSP90β Impedes STUB1-Induced Ubiquitination of YTHDF2 to Drive Sorafenib Resistance in Hepatocellular Carcinoma”。研究发现，HSP90β的表达与YTHDF2蛋白水平呈正相关，而STUB1的表达与YTHDF2和HSP90β的蛋白水平呈负相关。这些发现深化了对YTHDF2如何调控HCC进展的理解，并为治疗HCC提供了潜在的靶点。
背景介绍： 肝细胞癌（HCC）是一种具有高发病率和致死率的挑战性疾病，与晚期肿瘤诊断密切相关，生存率极低（不到6%）。此外，由于高度异质性，HCC患者很难从特定疗法中获益。因此，为了当前医学研究的需要，开发治疗HCC的关键治疗靶点是迫切的。作为维持蛋白质稳态和细胞功能的核心，泛素-蛋白酶体系统（UPS）控制大多数蛋白质的降解，并参与从不同层面的生物反应，如应激反应、DNA损伤反应和细胞增殖。泛素化是一个需要E1、E2和E3的级联反应。表观遗传修饰在许多肿瘤的发病机制中起着关键作用。与许多其他表观遗传修饰一样，m6A甲基化是一个可逆的过程。YTHDF2是第一个被发现的m6A结合蛋白，它在某些恶性肿瘤中上调表达，如胃癌、结直肠癌等，并可以促进它们的发展。功能上，YTHDF2通过调节特定mRNA的翻译和稳定性来控制蛋白质表达。然而，YTHDF2在HCC中的作用和修饰仍然不完全清楚。 图文解析：
图1 要点1： 为了探究YTHDF2在HCC进展中是否起关键作用，通过UALCAN网站使用公共TCGA数据库分析了不同阶段/分级的HCC中YTHDF2的mRNA表达。 A.YTHDF2在1-3期和1-4级的HCC中明显增加；分级越高的HCC组织中YTHDF2的表达越高。进一步利用公共TCGA数据库通过Kaplan-Meier曲线网站分析了YTHDF2表达与HCC患者生存之间的关系。 B.YTHDF2的上调与不良预后相关，包括总生存和无复发生存。接下来，检测了HCC样本（n=31）中YTHDF2的蛋白表达。 C-D.肿瘤组织中YTHDF2的表达高于邻近正常组织。接下来评估了YTHDF2蛋白表达的上调是否可能是由于YTHDF2的异常泛素化。在具有较高YTHDF2蛋白表达的样本中，对11对肿瘤或邻近正常组织进行了共免疫沉淀（co-IP）分析。通过共免疫沉淀结果中泛素蛋白密度/YTHDF2蛋白密度的比值来确定YTHDF2的泛素化水平。最终排除了N22/T22的样本，因为这些配对样本中YTHDF2的泛素化水平无法检测到。 E-F.与邻近正常组织相比，HCC组织中YTHDF2的泛素化水平显著降低。综上所述，这些发现表明泛素化水平的不足导致YTHDF2的过表达，并推动HCC的恶性进展。
图2 要点2： 据观察，YTHDF2在HCC样本中可以被泛素化修饰。因此，研究人员随后检查了蛋白酶体是否可以降解YTHDF2。 A.免疫沉淀结果显示，在HepG2和Hep3B细胞中，强效蛋白酶体抑制剂MG132短暂作用后，YTHDF2的泛素化水平明显上调，表明经典的泛素蛋白酶体途径降解YTHDF2。研究人员先前报道过热休克蛋白（HSPs/分子伴侣）在控制特定蛋白质降解中起关键作用。在本研究中，研究人员进一步调查了HSPs是否可以调节YTHDF2的泛素化并导致其异常表达。 B，C.共免疫沉淀实验结合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析显示，在HCC细胞中，HSP90β是与YTHDF2相互作用最重要的HSPs之一。正如先前报道的那样，STUB1是与HSP70/90相互作用的E3连接酶。因此，研究人员进行了共免疫沉淀和Western blotting实验，分别使用抗-YTHDF2、抗-STUB1和抗-HSP90β来检测它们之间的蛋白质相互作用。 D-F.YTHDF2、STUB1和HSP90β可以相互作用。接下来，在HCC细胞中进行了外源性免疫荧光（IF）、内源性IF、近距离连接和共聚焦显微镜实验，进一步阐明它们之间的亚细胞定位。 G-I.这些结果一致显示它们的相互作用主要定位在HCC细胞的细胞质中。因此，研究人员进一步探究了HSP90β是否存在与STUB1的特定结合域。 J.在质粒中构建了带有FLAG标签的HSP90β的截短突变体和全长突变体。这些质粒分别与HA-STUB1在HEK293T细胞中转染。 K.共免疫沉淀结果显示，HSP90β的大中间域和小中间域（276-602 aa）对其与STUB1和YTHDF2的结合至关重要。 L.此外，研究人员发现YTHDF2的N-末端（1-384 aa）对其与HSP90β的结合至关重要。HepG2细胞中的共免疫沉淀结果与HEK293T细胞中的发现一致。因此，上述结果表明HSP90β通过其大中间域和小中间域与YTHDF2（1-384 aa）和STUB1在细胞质中发生相互作用。
图3 要点3： 研究人员进一步确定了STUB1或HSP90β在YTHDF2表达中的作用。 A，B.Western blotting结果显示，STUB1敲低（KD）导致YTHDF2蛋白水平上调，而过表达逆转了这一过程。 C.此外，使用NVP-AUY922或HSP90β-KD抑制HSP90β导致HCC细胞中YTHDF2的下调。根据先前的报道，本研究中使用Bcl-2作为NVP-AUY922的效应标志物。 D，E.接下来，研究人员的CHX追踪分析显示，STUB1-KD显著延缓了YTHDF2降解的速率，而HSP90β的抑制明显加速了YTHDF2的降解。 F，G.同时，STUB1-KD和HSP90β抑制均未改变YTHDF2的mRNA水平。 H，I.此外，特异性蛋白酶体抑制剂bortezomib明显逆转了HSP90β抑制或STUB1过表达导致的YTHDF2下调。这些发现表明STUB1降低YTHDF2的蛋白稳定性，而HSP90β增加在HCC中YTHDF2的蛋白稳定性。
图4 要点4： 为了进一步确定HSP90β和STUB1是否可以改变YTHDF2的泛素化修饰，研究人员在HepG2细胞中进行了共免疫沉淀实验，这些细胞经过si-STUB1、NVP-AUY922或FLAG-HSP90β质粒的处理。 A，B.共免疫沉淀分析显示，在HCC细胞中，STUB1-KD显著降低了YTHDF2的K48链泛素化和全泛素化水平，而HSP90β抑制则上调了YTHDF2的泛素化水平。 C.此外，HSP90β的过表达降低了YTHDF2的K48链泛素化和全泛素化水平，并减少了STUB1与YTHDF2之间的相互作用。为了探究HSP90β调控YTHDF2是否真的通过STUB1介导，研究人员在HEK293T细胞中进行了共免疫沉淀实验，这些细胞转染了Myc-Ub、6×His-YTHDF2、HA-STUB1或FLAG-HSP90β质粒。 D.结果显示，STUB1的过表达显著增加了YTHDF2的泛素化水平，而进一步的HSP90β过表达降低了STUB1诱导的YTHDF2的泛素化水平。泛素化主要发生在赖氨酸残基上。为了研究YTHDF2的泛素化位点，根据泛素化位点预测网站GPS-Uber，研究人员构建了六个含有YTHDF2赖氨酸突变型的质粒。这些质粒分别转染到HEK293T细胞中。 E.共免疫沉淀结果显示，YTHDF2（K245A）的泛素化水平下调，而其他突变型的YTHDF2的泛素化水平没有改变，表明K245是YTHDF2的一个关键泛素化位点。 F.此外，研究人员的体外泛素化实验显示，STUB1直接触发了YTHDF2的泛素化，而HSP90β阻断了STUB1诱导的YTHDF2的泛素化。研究人员的发现表明HSP90β阻断了STUB1诱导的YTHDF2的泛素化修饰，从而维持了HCC细胞中YTHDF2的蛋白水平。
图5 要点5： 接下来，研究人员评估了HSP90β、YTHDF2和STUB1在调控HCC的恶性表型方面是否具有功能。细胞增殖实验在HSP90β/YTHDF2/STUB1-KD处理后的连续5天进行，观察细胞增殖情况。 A-D.STUB1-KD促进了HCC细胞的增殖，而HSP90β-KD或YTHDF2-KD抑制了HCC的增殖。研究人员进一步确定HSP90β/STUB1是否以YTHDF2为依赖因子调节HCC的增殖。 E，F.细胞增殖实验显示，在HepG2和Hep3B细胞中，YTHDF2的过表达显著逆转了HSP90β-KD或STUB1过表达引起的生长抑制。 G-I.此外，体内实验显示，在HepG2移植瘤中，YTHDF2的过表达逆转了HSP90β-KD或STUB1过表达引起的肿瘤抑制。接下来，研究人员的目标是确定哪些mRNA可能由YTHDF2调控，从而推动HCC的进展。据报道，OCT4是YTHDF2通过m6A RNA甲基化调控肝癌干细胞表型的下游效应子。YTHDF2上调了OCT4 mRNA 5'-非翻译区域的m6A水平，提高了OCT4的翻译和表达水平。因此，研究人员接下来评估了OCT4是否介导了HSP90β/STUB1调控HCC细胞增殖的作用。 J.结果显示，OCT4-KD显著逆转了STUB1-KD或HSP90β过表达引起的生长促进作用。这些发现揭示了HSP90β和STUB1在HCC细胞中具有相反的作用，这在很大程度上与它们在调控YTHDF2的泛素化修饰方面的相反功能有关。
图6 要点6： 索拉非尼（Sorafenib）是一种多激酶抑制剂，已成为晚期HCC最常用的靶向治疗之一。然而，索拉非尼对于延长HCC患者的总生存期的有效性仍然有限。因此，研究人员尝试确定通过抑制HSP90β诱导YTHDF2的降解是否可以增强HCC细胞对索拉非尼靶向治疗的敏感性。 A，B.首先，研究人员探究了NVP-AUY922对HCC细胞增殖的影响。NVP-AUY922显著降低了细胞存活率和集落形成能力。接下来，研究人员探究了NVP-AUY922与索拉非尼联合对HCC细胞增殖的影响。 C，D.研究人员发现，与单独使用NVP-AUY922或索拉非尼相比，该联合治疗显著降低了细胞存活率和集落形成能力。 E.此外，与单独治疗相比，该联合治疗在HCC细胞中更明显地诱导了凋亡。为了探究该联合治疗的体内效果，研究人员在裸鼠上建立了移植瘤模型。 F-I.结果显示，该联合治疗（NVP+AUY922）显著减小了HCC移植瘤的大小和重量，但没有影响体重。 J.此外，研究人员进一步证实，HSP90β-KD或YTHDF2-KD也恢复了HepG2和Hep3B细胞对索拉非尼的敏感性。 K.更重要的是，NVP-AUY922抑制HSP90β增加了HCC细胞中STUB1和YTHDF2的相互作用，表明NVP靶向的是HSP90β而不是YTHDF2。研究人员证明了通过诱导STUB1和YTHDF2的相互作用，抑制HSP90β可以增强HCC细胞对靶向治疗的敏感性。
图7 要点7： 研究人员在40例HCC患者的临床样本中探究了HSP90β/STUB1和YTHDF2之间的关系，以进一步验证研究人员在体外和体内的发现。 A-D.免疫组化（IHC）实验显示，与正常邻近组织相比，HCC组织中YTHDF2和HSP90β的蛋白表达上调，而STUB1的表达下调。 E，F.此外，YTHDF2的蛋白表达与HSP90β的表达呈正相关，而与STUB1的表达呈负相关。 G.同时，STUB1的蛋白表达与HSP90β的表达呈负相关。
图8 要点8： A，B.通过UALCAN对TCGA数据库的分析显示，HSP90β在各个HCC分期或肿瘤分级中具有较高的mRNA水平。 C.此外，Kaplan-Meier曲线的整体生存分析显示，HSP90β的高表达与HCC患者的不良生存相关，包括所有分期。 D-F.相反，STUB1的高表达预示着HCC患者的良好预后，包括2-4期。G.研究人员在HCC的临床组织中的发现与分子和细胞生物学结果高度一致，进一步支持了HSP90β阻碍STUB1诱导YTHDF2泛素化修饰以推动HCC的生长和对索拉非尼的不敏感性的假设。 本文小结： 综上所述，本研究从泛素化修饰的角度研究了m6A阅读蛋白YTHDF2的翻译后修饰。数据表明，HSP90β通过抑制STUB1诱导的YTHDF2泛素化修饰和降解，促进了HCC细胞的生长和对索拉非尼的耐药性，这为HCC的临床治疗开创了一种新的干预策略。 参考文献： Liao Y, Liu Y, Yu C, et al. HSP90β Impedes STUB1‐Induced Ubiquitination of YTHDF2 to Drive Sorafenib Resistance in Hepatocellular Carcinoma[J]. Advanced Science, 2023: 2302025. https://doi.org/10.1002/advs.202302025 |
