IF 64.8 Nature丨骨髓中的IL-4信号轴驱动促肿瘤性骨髓细胞生成

前言

2023年12月6日，美国西奈山伊坎医学院的Miriam Merad团队在Nature上在线发表题为“An IL-4 signalling axis in bone marrow drives pro-tumorigenic myelopoiesis”的研究论文，研究发现2型细胞因子白介素-4（IL-4）是肿瘤浸润的单核细胞源性巨噬细胞表型的主要驱动因子；揭示了来自骨髓的IL-4通过作用于粒细胞-单核细胞祖细胞，以转录方式编程免疫抑制性促肿瘤骨髓细胞的发育的分子机制。最终确定了IL-4在控制癌症免疫抑制性骨髓生成中的核心作用，确定了一种新的人类免疫检查点阻断联合疗法，并强调了癌症作为一种系统性疾病，需要在原发病灶之外采取治疗的策略。

背景介绍

非小细胞肺癌（NSCLC）每年在全球造成160多万人死亡。癌症进展的一个关键驱动因素被认为是肿瘤微环境(TME)，在非小细胞肺癌中由巨噬细胞主导，巨噬细胞通过多种机制支持肿瘤生长。我们之前使用遗传命运图谱来证明肺肿瘤中的巨噬细胞通过其个体发生在功能上分离:常驻组织巨噬细胞(RTMs)在胚胎发育期间出现，促进组织重塑和肿瘤侵袭。相比之下，单核细胞来源的巨噬细胞(mo-macs)在炎症性肿瘤提示下由骨髓祖细胞产生，主要通过抑制抗肿瘤免疫反应来促进肿瘤生长。骨髓细胞已知可抑制抗肿瘤免疫。然而，免疫抑制髓样细胞状态的分子驱动因素尚不明确。

图文解析

图1

要点1：a-b.2型细胞因子IL-4与免疫抑制mregDC程序的控制有关，阻断IL-4可显著降低原位KrasG12DTp53^−/−(KP)肺腺癌病变小鼠的肺肿瘤负荷和B16黑色素瘤肺转移模型。然而，令人惊讶的是，当树突状cells-Il4ra^ΔDC上缺乏IL-4Rα的小鼠时，通过将Zbtb46-cre13小鼠与IL-4ra-floxed小鼠杂交产生KP细胞，这些小鼠与野生型幼崽相比，肺部肿瘤负荷没有差异。c-d.同样，在RTMs(通过CD169-cre14)或T细胞(通过CD4-cre15)上特异性缺乏IL-4Rα的小鼠与对照组相比，肿瘤负荷没有差异。由于KP细胞本身对IL-4治疗没有反应，得出结论，另一种免疫细胞类型必须对IL-4作出反应以促进肿瘤发展，并转向我们的人类和小鼠NSCLC转录数据集以获得见解。e-f.将Il4ra-floxed小鼠与Ms4a3-cre小鼠杂交。其中，Cre在骨髓中的粒细胞-单核细胞祖细胞(GMPs)中高度且短暂表达，在所有下游免疫谱系中诱导基因缺失，主要是单核细胞、单核细胞和中性粒细胞，同时保留RTMs16。在KP肿瘤攻击后，Il4ra^ΔMs4a3小鼠的肿瘤负荷比野生型小鼠减少了85%，这表明IL-4信号在粒细胞-单核细胞谱系中在肿瘤发展中起着核心作用。g-h.值得注意的是，在携带Ms4a3-cre等位基因而不携带floxed等位基因的小鼠中，肿瘤负荷没有减少，排除了Cre表达的任何脱靶效应。虽然循环中性粒细胞和其他肺髓细胞群的数量没有变化，但荷瘤Il4ra^ΔMs4a3小鼠的肺单核细胞和循环单核细胞的数量是对照组的一半。鉴于mo-mac数量的显著减少，人类转录数据表明IL-4Rα信号传导在mo-mac室中的作用，以及对非小细胞肺癌中单核细胞和巨噬细胞分子程序的详细了解，研究人员选择将研究主要集中在单核细胞-mo-mac谱系上。j.由于Ms4a3-cre同时靶向单核细胞和中性粒细胞谱系，接下来将Il4ra-floxed小鼠与Cx3cr1-cre24或S100a8-cre25驱动因子杂交，它们在GMP下游更成熟的骨髓细胞中表达，并且分别强烈偏向单核细胞和中性粒细胞谱系。k.值得注意的是，S100a8-cre缺失对粒细胞谱系是特异性的，尽管事实上S100a8在炎症环境下的其他髓系细胞中表达水平较低。出乎意料的是，尽管在靶细胞群中有效地缺失了IL-4Rα，但Il4ra^ΔCx3cr1小鼠和Il4ra^ΔS100a8小鼠在受到KP细胞攻击时都没有表现出肺肿瘤负荷的减少。因此，尽管骨髓中早期髓系祖细胞中IL-4Rα的缺失驱动了肺TME的大量重塑和肺肿瘤负荷的减少，但成熟的mo-macs和中性粒细胞的缺失没有影响。

图2

要点2：a.Il4raΔMs4a3单核细胞表达的与单核细胞成熟相关的基因水平要高得多，包括受体编码基因Csf1r和Csf2rb以及转录因子基因Nr4a1和Nr4a228。它们同时表达较低水平的Ly6a(编码SCA-1，一种在早期造血祖细胞上高表达的受体)、Bach2和S100a9，这些都与髓系发育的早期阶段有关。b-c.基于表面标记物，观察到不同基因型小鼠的GMP数量没有差异。然而，尽管Il4ra^+/+的荷瘤小鼠表现出两倍的gmp扩增，但这种扩增在Il4ra^ΔMs4a3小鼠中完全消失。尽管所有GMP亚群都表达低基线pSTAT6，但在肿瘤攻击时，染色增加了三倍，这表明骨髓是NSCLC中髓系IL-4Rα信号传导的相关部位。d-f.发现Il4raΔMs4a3 gmp和下游血液单核细胞在同一动物体内的扩增明显低于野生型，这表明稳态下IL-4Rα信号传导在单核细胞形成中具有竞争优势。同样，Il4raΔMs4a3造血祖细胞向颗粒-巨噬细胞谱系分化的能力有限。为了进一步确定IL-4信号传导在骨髓形成中的作用，用IL-4复合物(IL-4c)(其中IL-4被IL-4抗体稳定以延长其体内半衰期)或载体对照处理野生型小鼠，并量化了从最早的造血干细胞(HSC)到血液单核细胞的单核细胞发育途径中的骨髓中间体。IL-4c处理对早期HSC没有影响，但诱导gmp和所有下游种群急剧而深刻地扩增，LY6C−gmp在4天内扩增了3倍。g.接下来，检查了这三个群体中每个群体的条件特异性DEG，重点关注与初始对照组相比，在IL-4c和KP处理组中表现出相似行为的基因。

首先，我们将GLAST+CD133+细胞投影到统一流形近似和投影(UMAP)上，根据已发表的数据(GSE67833)可视化聚类(图2A)。这些NSCs被分成aNSCs和qNSCs, aNSCs高表达Egfr(已知的活性NSCs的标记物)

图3

要点3：a-b.研究发现几乎所有在肿瘤小鼠骨髓中产生的IL4-eGFP都来源于嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，它们总共约占骨髓细胞的5%。这些细胞—通常被称为2型粒细胞，因为它们能够产生几种2型效应细胞因子—在稳定状态下在外周组织中通常很少或不存在，但在TH2驱动的炎症反应中迅速积累。尽管在荷瘤小鼠中骨髓嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的数量没有增加，但与未处理的对照组相比，它们明显上调了IL4-eGFP的表达。c.通过静脉注射(IV)CD45标记，将进入肺实质的免疫细胞(CD45-IV⁻)与通过血液循环的组织外细胞(CD45-IV⁺)分离开来，发现嗜酸性粒细胞在肿瘤攻击时迅速进入肺实质。然而，100%的嗜碱性粒细胞(CD45-IV⁺)在幼稚和肿瘤小鼠的循环中保持不变，并且不会迁移到肺肿瘤中。d-e.在这两种情况下，与接受对照同型抗体的小鼠相比，嗜碱性粒细胞耗损大大降低了肿瘤负荷。f.与嗜碱性粒细胞IL-4是癌症骨髓生成的主要驱动因素的模型一致，嗜碱性粒细胞缺失的小鼠骨髓gmp明显减少，转化为肺单核细胞和肺单核细胞减少。因此，嗜碱性细胞是骨髓中主要的IL-4来源，而在肺肿瘤中不存在，它们的消耗消除了免疫抑制性骨髓生成并减轻了肿瘤负担。j.已知实体瘤通过肿瘤细胞本身和基质成分产生的可溶性因子影响造血。与此相一致的是，用KP细胞条件培养基培养骨髓嗜碱性细胞可显著上调IL4-eGFP。接下来，使用Luminex多重ELISA检测幼年和KP荷瘤野生型小鼠肺匀浆中的蛋白。值得注意的是，据报道，在嗜碱性粒细胞46中诱导IL-4产生的8种蛋白在肿瘤小鼠的肺中表达上调:IL-18、VEGF-A、IL-6、IL-1α、IL-7、CCL3、IL-15和CSF2。k.与健康对照组相比，未接受治疗的非小细胞肺癌患者血清中的6种蛋白也出现上调，其中3种IL-6、VEGF-A和IL-18具有统计学意义。然后，直接测试了这8种细胞因子在个体培养中诱导骨髓嗜碱性细胞中IL-4的能力。l.当单独培养时，许多这些细胞因子诱导4get嗜碱性细胞中IL4-eGFP的适度上调;然而，当所有细胞因子组合在一起时，存在明显的协同作用，嗜碱性细胞在与八种细胞因子组合鸡尾酒培养时，GFP平均荧光强度上调两倍。因此，人类和小鼠非小细胞肺癌中产生的多种细胞因子协同作用，诱导骨髓腔室内产生IL-4。总的来说，这些数据定义了一个模型，其中骨髓2型粒细胞感知由NSCLC肿瘤产生的远端信号，随后通过产生IL-4指导免疫抑制性骨髓细胞的发展。

图4

要点4：a-b.在携带原位HKP1肿瘤的小鼠中，抗IL-4治疗增强了对抗PD-l1免疫治疗的反应，这表明了协同作用。HKP1是KP肿瘤的一种变体，更具免疫原性，对检查点blockade有部分反应。从每个SOC继续进行PD-1/PD-L1阻断，而患者每3周皮下接受Dupilumab，共3次剂量，第1天的负荷剂量为600mg，随后的维持剂量为300mg，与持续的PD-1/PD-L1阻断抗体一起给药。没有观察到剂量限制性毒性或治疗相关的不良事件。c-d.值得注意的是，研究发现Dupilumab联合给药可促进促炎细胞因子的快速上调(第4天)，这些细胞因子已知可促进抗肿瘤免疫反应，包括T辅助1(TH1)免疫轴(IFNγ和IL-12)的中心驱动因子，以及T细胞募集趋化因子CCL19、CXCL9、CXCL10。长期(第43天)，T效应细胞扩张因子上调，包括IL-2、IL-7、CCL25和IL-15RA。全血细胞计数飞行时间(CyTOF)显示，随着时间的推移，一些患者的炎症(CD14⁺)单核细胞稳步减少，但对循环粒细胞的影响很小，反映了在患肿瘤IL4ra^ΔMs4a3小鼠中的结果。此外，Dupilumab诱导循环效应CD8 T细胞和产生抗体的浆细胞的扩增，这两者对于PD-1/PD-L1阻断的反应都是必不可少的。e.免疫组化分析来自3例患者的配对肿瘤活检，在Dupilumab开始前和36天后获得，显示TME伴随重构。在所有被分析的患者中，Dupilumab诱导CD8 T细胞(CD8α⁺)扩增，激活树突状细胞(DC-LAMP⁺)和B细胞(CD20⁺)，表明在PD-1/PD-L1阻断下，T细胞启动能力和细胞毒性免疫功能增强。f.值得注意的是，根据RECIST(实体肿瘤反应评价标准)标准，这6名患者中有1名在影像学检查中出现了部分临床反应。根据方案，该患者继续接受维持检查点封锁与杜匹单抗同时进行，在三次剂量的杜匹单抗后，在第一次成像后继续单独接受维持派姆单抗;随后的两次放射学评估显示，在治疗开始9个多月后，放射学反应加深，PET扫描几乎完全缓解。

全文小结

综上所述，本研究首次证实IL-4在控制非小细胞肺癌中单核细胞和mo-mac免疫抑制方面发挥核心作用，并发现IL-4信号传导的关键部位并非肿瘤本身，而是骨髓。在骨髓中，IL-4作用于GMP，影响髓系细胞的命运。此外，本研究还确定了抗IL-4Rα单抗Dupilumab在调节癌症抗肿瘤免疫反应中的重要作用，为未来的研究提供了重要且具有启发性的方向。

参考文献：

LaMarche, N.M., Hegde, S., Park, M.D. et al. An IL-4 signalling axis in bone marrow drives pro-tumorigenic myelopoiesis. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06797-9