IF 12.4 Molecular Therapy丨分化干细胞释放的细胞外囊泡在超低剂量下诱导血管生成反应

前言

2023年12月13日英国爱丁堡大学的研究团队在《Molecular Therapy》杂志上在线发表了题为“Extracellular vesicles from differentiated stem cells contain novel proangiogenic miRNAs and induce angiogenic responses at low doses”的研究论文。极低浓度的hESC-ECP来源的EVs（hESC-eEVs）在体外促进EC管形成和伤口愈合，并发现了具有潜在新血管生成功能的EVs miRNAs（miR-4496，miR-4691-5p）。

背景

来自健康内皮细胞（ECs）释放的细胞外囊泡（EVs）已显示出促进血管生成的潜力，但它们的治疗效力仍然知之甚少。此前的研究显示，移植人类胚胎干细胞衍生的内皮细胞产品（hESC-ECP）有助于在小鼠急性缺血性疾病中促进新血管形成，而这可能通过一种旁分泌的机制实现。

图1

要点1：A.为了分离hESC-eEV，多能hESCs通过中胚层阶段进行了8天的分化方案。B.采用超滤和粒径排除色谱(SEC)相结合的方法从HESCECP条件培养基中分离EV。C.通过表征EV的大小分布、表面标记和形态来评估EV的富集程度。纳米颗粒跟踪分析(NTA)表明，分离颗粒的大小在30-200nm之间，平均值为84±7.3nm。D.Western blot分析证实，这些颗粒的EV标记物CD63和CD81呈阳性，内质网标记物calnexin呈阴性。E.利用透射电镜(TEM)，确定了EV的特征尺寸和形状的结构。定量TEM图像显示，平均EV尺寸为100.42±38.36nm，圆度比为0.96±0.06。这些高纯度EV制剂从此被称为hESC-eEV。

图2

要点2：A.使用HUVEC缺氧EVs进行剂量响应实验，证明这些EVs在低剂量(<100EVs/细胞)下诱导EC管形成无效，在高剂量(105EVs/细胞)下效果最高。B.相比之下，与阴性对照相比，每个细胞约1个hESC-eEV处理导致HCMEC管形成显著增加(p<0.0001)。C.还发现，与HUVEC缺氧EV相反，高hESC-eEV浓度(R100ev/细胞)处理不能复制这种效果。Calcein AM染色证实了试管中所有条件下的细胞活力地层分析。为了了解对血管生成的影响是否对hESC-eEV具有特异性，测试了分化方案中胚层阶段(hESC-mEV)衍生的EV的血管生成潜力。D.结果显示，与一个hESC-eEV细胞相比，hESC-eEV在任何剂量下都没有诱导成管。E.为了确认hESC-eEV处理后观察到的促血管生成作用是针对EV而不是其他可溶性细胞培养基相关因素，将完整的培养基(无条件/不暴露于细胞)置于EV纯化过程中，并在纯化的不同阶段收集样品。F.对这些样品进行了诱导HCMEC形成管的能力测试。研究结果表明，经过EV纯化过程的完整培养基处理并不能提高HCMEC管的形成能力，而从条件培养基(hESC-eEV/细胞)中分离的EV处理则促进了HCMEC管的形成。因此，在hESC-eEV治疗后观察到的促血管生成作用不太可能是与可溶性细胞培养基相关的因素有关。

图3

要点3：为了评估hESC-eEV对体外伤口愈合的影响，使用增加浓度的hESC-eEV进行了伤口愈合试验，最大剂量为100hESC-eEV/细胞。

图4

要点4：hESC-eEV富含具有潜在的新型促血管生成功能的miRNA，因为EV的作用主要归因于它们的小RNA载货，研究人员目标是鉴定负责hESC-eEV促血管生成潜力的RNA分子。A.从以下样品中提取RNA:hESC-eEV,hESC-mEV和HUVEC缺氧EV(n=3个独立分化)，还从hESC-ECPs中提取RNA，以鉴定细胞供体细胞上EV中富集的miRNAs。RNA大小分析显示，EVs、核糖体和更长的RNA中富集了小RNA(25-200nt)杂RNA和蛋白质编码RNA。B.hESC-mEV中排名前5位的miRNA含有被广泛研究的驱动血管生成的分子，而hESC-eEV中排名前5位的miRNA大多数具有抗血管生成作用。分子治疗的文献检索每个样本中最丰富的20个miRNA(对应于总读取量的68%-86%)显示存在几种未报道的在hESC-eEV血管生成中起作用的miRNA。C.由于文献检索在提供所有miRNA血管生成潜力方面的局限性，通过进一步鉴定了具有潜在新型血管生成功能的hESC-EV-miRNA。D.在hESC-eEV和hESC-mEV之间表达差异最大的20个miRNA中，有5个在hESC-eEV中表达特别高(每百万映射[RPMM]>3,000)。E.还注意到，与hESC-mEV相比，hESC-eEV缺乏miR-302家族的miRNA，而miR-302家族可以调节从幼稚多能性到引物多能性的转变，并且据报道可以抑制血管生成。

图5

要点5：接下来，研究人员的目标是研究hESC-eEV是否携带新的EVmiRNA，即在以前的EV小RNA测序研究中未报道的miRNA。A.为了鉴定hESC-eEV中潜在的新型EV相关miRNA，将hESC-eEV中存在的miRNA列表(RPMM>10)与Vesiclepedia和ExoCarta数据库中报道的先前鉴定的EV相关miRNA列表进行了比较。这一比较共产生了24个先前分析的EV中缺失的miRNA。在所鉴定的24个miRNA中，miR-4496和miR-4691-5p在hESC-eEV中表达特别高(RPMM>3000)。这表明miR-4496和miR-4691-5p可能在hESC-eEV中富集。B-C.miR-4496是hESC-eEVs中最富集的miRNA，同时也是hESC-eEVs和hESC-ECPs之间倍数变化最大的5个miRNA中含量第三高的miRNA。

图6

要点6：为了检验miR-4496和miR-4691-5p潜在的促血管生成作用，对过表达每种miRNA的HCMECs进行了管形成和伤口愈合实验。A.通过管形成实验，发现在基础条件下和在完全补充的培养基中培养细胞时，这两种miRNAs都显著增加了形成的管的数量和总长度。B.通过伤口愈合实验，证明在伤口诱导24小时后，转染miR4496或miR-4691-5p的HCMECs在基础条件下(p<0.001)和在完全补充的培养基中(p=0.0079和p=0.0099)均显著改善了伤口愈合。因此，数据验证了miR-4496和miR-4691-5p是具有新型促血管生成功能的miRNA。

小结

综上所述，研究证明了hESC-eEVs在超低剂量下是EC血管生成反应的强效诱导剂，并包含了独特的EV相关miRNA谱系，其中包括具有新的促血管生成功能的miR-4496和miR-4691-5p。

参考文献：Despoina K、Matthew B、João P.M.et al.Extracellular vesicles from differentiated stem cells contain novel proangiogenic miRNAs and induce angiogenic responses at low doses. Mol Ther 2023.

https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2023.11.023