IF 19.3 Molecular Cell丨细胞过度生长增强渗透和复制应激以促进p38/p53/p21依赖性衰老

前言

2023年11月16日，来自英国邓迪大学的Tony Ly团队等多个团队在Molecular Cell杂志上合作发表了一篇题为“Cell overgrowth potentiates osmotic and replication stresses to promote p38/p53/p21-dependent senescence”的研究论文，研究人员将活细胞成像与定量蛋白质组学相结合，证明CDK4/6i的长期处理会导致细胞过度生长，而渗透应激和复制应激导致p53活化，其下游的p21水平升高，促使细胞周期的永久性退出。这些发现解释了细胞过度生长如何驱动衰老，以及CDK4/6抑制剂为何对患者具有长效作用。

背景介绍

CDK4/6抑制剂(CDK4/6i)在治疗激素受体阳性(HR+)，人表皮生长因子受体2阴性(HER2−)转移性乳腺癌中的成功1,2,3重新激发了靶向细胞周期进入途径治疗癌症的兴趣。4,5 CDK4/6和d型细胞周期蛋白形成活性激酶复合物，磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)6，促进G0-G1进展和s期进入CDK4/6抑制导致Rb低磷酸化，从而抑制细胞周期基因的转录。临床、动物模型和体外实验的结果表明，CDK4/6抑制的作用机制是复杂的。8,9,10,11例如，尽管RB1中耐药驱动的遗传病变频率很高，但其他遗传病变如何驱动CDK4/6i耐药的机制却不能如此容易地解释。CDK4/6i对免疫系统有意想不到的影响，14,15,16,17，动物模型中的肿瘤细胞清除依赖于T细胞功能因此，我们目前对cdk4 /6i介导的肿瘤细胞清除的分子机制的理解存在重   CDK4/6抑制剂(CDK4/6i)在治疗激素受体阳性(HR⁺)，人表皮生长因子受体2阴性(HER2⁻)转移性乳腺癌中的成功重新激发了靶向细胞周期进入途径治疗癌症的兴趣。 CDK4/6和d型细胞周期蛋白形成活性激酶复合物，磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)，促进G0-G1进展和S期进入CDK4/6抑制导致Rb低磷酸化，从而抑制细胞周期基因的转录。临床、动物模型和体外实验的结果表明，CDK4/6抑制的作用机制是复杂的。例如，尽管RB1中耐药驱动的遗传病变频率很高，但其他遗传病变如何驱动CDK4/6i耐药的机制却不能如此容易地解释。CDK4/6i对免疫系统有意想不到的影响，动物模型中的肿瘤细胞清除依赖于T细胞功能因此，目前对CDK4/6i介导的肿瘤细胞清除的分子机制的理解存在重大空白。

图文解析

图1

要点1：A-B.Palbociclib用CDK4/6i治疗未转化的hTERT-RPE1 (RPE1)和ER⁺乳腺癌MCF7细胞，导致细胞在G0/G1中停滞。延长RPE1或MCF7细胞用CDK4/6i治疗的时间，伴随着细胞大小的增加，这与CDK4/6i治疗的时间有关。C-D.细胞大小的增加伴随着细胞蛋白和RNA含量的增加。先前的研究表明，CDK4/6i治疗2天后，CDK4/6i洗脱后的S期再入率下降。E.与此一致，观察到S期再进入与CDK4/6i治疗时间和细胞大小呈负相关。F.mTOR是细胞生长的主要调节剂，与雷帕霉素(mTORC1活性抑制剂)共同处理时，在CDK4/6i处理期间，RPE1和MCF7细胞的细胞生长都降低了。G.事实上，CDK4/6i和雷帕霉素的联合治疗恢复了细胞在抑制剂洗脱后重新进入S期的能力，这表明细胞过度生长是CDK4/6i洗脱后长期G0/G1停滞的主要驱动因素，而不是CDK4/6i的治疗时间。H.为了了解CDK4/6i缺失后的细胞周期行为，研究人员在RPE1细胞中使用了FUCCI细胞周期报告基因。细胞分别用CDK4/6i或CDK4/6i加雷帕霉素处理。在CDK4/6i洗脱后，大约20%的经CDK4/6i处理的RPE1 FUCCI细胞仍处于G0/G1期，而在那些确实重新进入S期的细胞中，很大一部分退出了S/G2期的细胞周期，如前所述用雷帕霉素共处理阻止细胞生长，使更多的细胞重新进入S期，G1期更短，完成G2并进入有丝分裂的细胞比例更高。

图2

要点2：A.CDK抑制剂蛋白p21的水平在CDK4/6i治疗2天后开始增加，并且已经证明p21的关键转录因子p53是在CDK4/6i治疗冲洗后观察到的长期细胞周期阻滞表型所必需的。 p21的增加与CDK4/6i缺失后细胞重新进入S期的能力丧失相关，并且是p53依赖性的。B.此外，使用定量蛋白质组学(见STAR方法)，观察到CDK4/6i处理后p21蛋白的增加，以及其他p53靶点的表达增加。C.与蛋白质组学数据一致，western blotting显示p21随着总蛋白含量的增加而增加。D.p21通过直接的化学计量结合抑制CDK1和CDK2。在大细胞中，CDK1和CDK2保持不变甚至降低。因此，p21相对于其抑制靶点的比例随着细胞大小的增加而增加。在添加DMSO、CDK4/6i或CDK4/6i加雷帕霉素后，RPE1 m红宝石-pcna p21-GFP细胞的成像显示，在添加CDK4/6i后约48小时，p21-GFP表达显著增加。p21-GFP表达的增加与2天后cdk4 /6i诱导的骤停的可逆性丧失相吻合。雷帕霉素共处理可在48小时减弱核p21- gfp荧光的增加。E.与此一致的是，CDK4/6i和雷帕霉素共处理细胞可阻止总细胞提取物中p21蛋白的积累和RPE1和MCF7细胞中核p21的积累。F.为了测试p21是否需要介导CDK4/6i缺失后的长期G0/G1阻滞，用CDK4/6i处理p21野生型和p21敲除(KO) RPE1细胞7天，并观察到，在CDK4/6i缺失后，与p21WT细胞相比，p21KO细胞能够重新进入S期的比例增加。G.使用p21WT或p21KO RPE1 mRuby-PCNA细胞的活细胞成像，观察到p21缺失减少了长期的细胞周期阻滞，在没有p21的情况下，所有细胞在CDK4/6i释放后进入S期，G1期更短，完成多次有丝分裂。

首先，我们将GLAST+CD133+细胞投影到统一流形近似和投影(UMAP)上，根据已发表的数据(GSE67833)可视化聚类(图2A)。这些NSCs被分成aNSCs和qNSCs, aNSCs高表达Egfr(已知的活性NSCs的标记物)

图3

要点3：A-C.在CDK4/6i处理7天后对RPE1 mRuby-PCNA p21-GFP细胞进行成像，以量化释放后p21-GFP的表达。在处于G0/G1期的细胞中，p21-GFP水平仍然很高。在重新进入S期的细胞中，p21- GFP在进入S期之前立即降解，然后在细胞进入G2时重新表达，导致p21的第二波表达(蓝色曲线)。在CDK4/6i加雷帕霉素处理的细胞中，p21-GFP水平在释放时(0 h)较低，大多数细胞重新进入S期(蓝色曲线)，尽管在S期退出后，p21-GFP确实在一些细胞中开始积累，但总体水平低于仅用CDK4/6i处理后的水平(红色曲线)，并且在G2中较少细胞停滞。

D-F.事实上，与雷帕霉素共同处理可以减少CDK4/6i缺失48小时后细胞中存在的DNA损伤量。这种差异不是由于G0/G1阻滞期间的DNA损伤，因为没有证据表明DNA损伤在CDK4/6i.G-H.治疗7天期间累积此外，观察到，当细胞从7天的CDK4/6i处理中释放出来时，复制叉的进展减少，当与雷帕霉素或一种不同的mTOR抑制剂PF-05212384 共同处理细胞过度生长时，复制叉的进展在很大程度上恢复。26,35在MCF7细胞中也观察到这种效应。观察到，在CDK4/6i处理7天后释放的细胞中，补充核苷可以恢复复制叉的进展，这表明核苷酸在过度生长的细胞中是有限的。

图4

要点4：A-C.在CDK4/6i细胞中，高渗介质抑制p21的诱导。对细胞大小的影响可以忽略不计或很小，可能是因为高渗介质治疗的时间尺度(3天)和稳态调节体积的增加除了抑制p21诱导外，高渗介质还降低了药物洗脱后4天和7天CDK4/6i治疗后持续G0/G1和G2停搏的频率。D-F.渗透胁迫激活了与应激相关的p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)相关的信号通路在我们的蛋白质组学数据集中检测到该途径中的许多蛋白质，并显示在CDK4/6i处理期间增加。支架蛋白OSM (CCM2)招募Rac、MEKK3和MKK3来激活p38MAPK。OSM在CDK4/6i第4天和第7天增加40至60倍。MKK3和p38MAPK总水平升高。为了进一步探讨这一点，通过测量磷酸化p38MAPK pT180/pY182向组蛋白H3的正常化来检测活性p38MAPK，允许与蛋白质组学数据进行直接比较。大细胞中总p38和磷酸化p38增加(7天增加约7倍)，磷酸化hsp27 (p38活性的下游读数)增加明显更多(7天增加23倍)，与p38MAPK通路信号增加一致。G-H.在CDK4/6i处理的大细胞中，D-山梨醇水平增加3.7倍，表明AR和SORD的变化导致细胞内山梨醇浓度的净增加。使用SB-203580 (p38i54)抑制p38可显著降低CDK4/6i处理细胞中的D-山梨醇水平，表明p38活性对观察到的D-山梨醇增加很重要。其他渗透物也增加，包括左旋肉碱和甜菜碱。基于这些观察，得出结论，CDK4/6i处理的细胞中关键的细胞内渗透物增加，与过度生长细胞中的积极渗透适应反应一致。

图5

要点5：A-B.p38MAPK是渗透和其他细胞应激下游的核心信号节点55激活p53并增加p21,为了测试p38MAPK活性是否在p21诱导的第一波中起作用，分别用CDK4/6i单独或CDK4/6i和p38i联合处理细胞54CDK4/6i和p38i共处理的细胞生长到与单独处理CDK4/6i相似的大小。与p38i共处理几乎完全阻止了CDK4/6i后p21的诱导。渗透胁迫也能激活相关应激诱导的JNK激酶然而，与靶向JNK1/2/3的小分子JNK抑制剂(JNK-in-8)共同处理，未能阻止p21的诱导。C.p21-GFP水平在CDK4/6i处理48小时后升高。相比之下，p21-GFP的诱导不仅在CDK4/6i和p38i共处理的细胞中受到抑制，而且在同一时间点左右降低。研究得出结论，p38MAPK活性是延长G0/G1骤停期间p21诱导所必需的。D.接下来，研究了p38i对p21诱导的抑制是否会导致长期细胞周期阻滞表型的恢复。RPE1 mRuby-PCNA细胞与CDK4/6i和p38i共同处理显著降低了G0/G1停滞的细胞比例。E.然而，在完成S期后，从CDK4/6和p38双重抑制中释放出来的细胞上调p21-GFP。还观察到固定细胞中p21升高(。研究人员认为这是因为CDK4/6i和p38i共处理的细胞仍然过度生长，并且在CDK4/6i释放后的第一个S期可能仍然经历复制应激。F.因此，量化了CDK4/6i和p38i共处理释放的细胞的DNA损伤水平，发现DNA损伤水平与CDK4/6i单独处理的细胞相当。衰老的另一个关键标志是衰老相关分泌(SASP)表型。长期使用CDK4/6i治疗可显著增加促炎细胞因子IL-6的分泌。G.当细胞从CDK4/6i中释放并进入持久的细胞周期阻滞时，高IL-6的产生继续。与p38i共处理可消除IL-6的产生。H.在长期使用CDK4/6i治疗后，趋化因子CCL2也上调，并且在CDK4/6i释放后进一步升高。在CDK4/6i介导的阻滞期间，CCL2被p38i联合治疗抑制，但与IL-6不同，CCL2在药物洗脱后上调。

图6

要点6：

细胞的生长和增殖相互作用，调节细胞的大小。解偶联这些过程对细胞有重大的负面影响，但这种解偶联是如何在分子水平上转导的仍在研究中。已经证明，在长时间的CDK4/6抑制期间，细胞过度生长促进了长期的细胞周期阻滞，即使在药物洗脱后也是如此。长期细胞周期阻滞依赖于p53依赖性p21蛋白的表达。p21的表达表现为至少两种不同的细胞应力驱动的两个波。

全文小结

综上所述，CDK4/6的长期抑制会导致细胞过度增生，进而引发持久的细胞周期停滞。这一现象是由至少两种不同的细胞应激（即渗透应激和复制应激）所引发的p53依赖性p21高表达所驱动。这些研究结果揭示了CDK4/6抑制剂在癌症治疗中发挥长效作用的机制。

参考文献：

Crozier L, Foy R, Adib R, et al. CDK4/6 inhibitor-mediated cell overgrowth triggers osmotic and replication stress to promote senescence[J]. Molecular Cell, 2023, 83(22): 4062-4077. e5.

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.10.016