IF 16.6 Nature Communications│小胶质细胞对隐球菌性脑膜炎作用解析

前言

2023年11月8日，伯明翰大学免疫与免疫治疗研究所Rebecca A. Drummond研究团队在Nature communications杂志发表了“Microglia are not protective against cryptococcal meningitis”的文章，研究揭示了小胶质细胞对隐球菌性脑膜炎没有保护作用。

背景介绍

组织驻留巨噬细胞在体内各器官分布，维持内环境稳定，并具有免疫监视功能。中枢神经系统中有脑膜、血管和脑实质的巨噬细胞群，其中小胶质细胞数量最多。这些细胞来源于胚胎前体，依赖CSF1R信号维持，对大脑发育至关重要。成年后，小胶质细胞主要负责免疫监视和脑感染防御。中枢神经系统易受多种病原体感染，如细菌、病毒、寄生虫和真菌。小胶质细胞对感染快速反应，如对嗜神经冠状病毒塑造CD4 T细胞反应，对弓形虫感染产生IL-1α等。念珠菌感染时，小胶质细胞依赖CARD9激活抗真菌免疫。真菌引起的CNS感染罕见且治疗困难，最常见的隐球菌导致隐球菌脑膜炎，影响免疫缺陷患者。小胶质细胞对真菌感染的反应尚不明确，但研究表明其在摄取和存活真菌、激活MHCII类和iNOS表达方面起作用。此外，中枢神经系统和脑组织的微环境影响真菌适应和器官特异性免疫反应，而组织内巨噬细胞可能调节微量营养素获取和营养免疫。组织内巨噬细胞是否通过调节对微量营养素的获取来驱动这些真菌适应，以及营养免疫对器官特异性免疫反应的影响，目前尚不清楚。

图文解析

图1

要点1：a.这些实验表明5%的小胶质细胞被新生隐球菌感染。b.小胶质细胞是大脑中数量最多的感染细胞类型，与中性粒细胞、单核细胞和炎性巨噬细胞相比，检测到的感染小胶质细胞数量明显更多。c.当检测大脑中总感染髓系细胞的比例时，小胶质细胞占所有真菌感染细胞的近一半。d-e.通过组织学对真菌定位的分析表明，酵母在脑实质中生长，与宿主细胞紧密相关或在细胞内生长，在组织损伤区域内与宿主细胞几乎没有关联(细胞外生长)。共聚焦显微镜显示，具有内化酵母的小胶质细胞具有典型活化的圆形、阿米巴样形态。这些被感染的细胞常被发现在组织损伤部位附近，这些组织损伤部位含有大量的胞外酵母。随着感染的进行，大面积的组织损伤伴随着胞外酵母的生长更加突出。f.事实上，与感染后第3天相比，胞外酵母(通过组织学测定)的比例在感染后第6天增加。g.研究人员在人脑中观察到了类似的生长模式。对1例HIV相关隐球菌性脑膜炎死亡患者的脑组织进行病理分析，可见广泛的组织损伤区域，有大量的细胞外酵母，其他区域可见酵母定居在免疫细胞内。总之，这些数据表明组织驻留的小胶质细胞和新生隐球菌之间存在着密切的关系。

图2

要点2：a.首先，研究人员构建了Cx3cr1-Cre^ER-iDTR^flox动物，在白喉毒素处理后，大脑中所有长寿命的CX3CR1⁺细胞被清除。小胶质细胞高表达CX3CR1，与其他CX3CR1⁺髓系细胞不同，小胶质细胞不从骨髓中补充。因此，研究人员可以将白喉毒素受体(DTR)的表达只靶向长寿命细胞，包括一个外周免疫细胞从骨髓中翻转的休息期。b.为了检测小胶质细胞在实验性新型隐球菌感染中的作用，研究人员使用了酵母细胞直接侵入中枢神经系统并绕过肺部免疫的静脉感染模型，使研究人员能够分离中枢神经系统内的宿主-真菌相互作用。使用Cx3cr1-Cre^ER-iDTR^flox小鼠，研究人员发现在真菌感染过程中，CX3CR1^hiCD45^int小胶质细胞的耗竭得以维持。c.在新型隐球菌攻击后，研究人员发现敲除小胶质细胞的小鼠脑部真菌负荷显著降低，但肺部真菌负荷无差异，表明敲除小胶质细胞可能具有保护作用。e-f.为了证实这些发现，研究人员采用了一种独立的小胶质细胞清除策略，使用CSF1R抑制剂PLX5622，它中断了小胶质细胞存活所需的CSF1R依赖的信号传导。g-h.研究人员发现，在感染后早期，与未治疗的对照组相比，PLX5622治疗的小鼠的真菌脑负荷也降低，而肺负荷保持不变。然而，与Cx3cr1-Cre^ER-iDTR^flox小鼠相比，研究人员发现PLX5622处理的小鼠在感染后第6天的真菌脑负担没有差异。在这两个模型中，研究人员发现小胶质细胞的缺失对炎症髓系细胞如Ly6Chi单核细胞和中性粒细胞向大脑的募集几乎没有影响。总之，这些数据表明，小胶质细胞不能对新生隐球菌感染提供保护，并且这些细胞的耗竭可能在早期时间点支持真菌的生长。

图3

要点3：a-b.Sall1是小胶质细胞的标志性基因，由小胶质细胞特异性表达，但不被其他中枢神经系统驻留或炎症巨噬细胞表达。研究人员通过建立Sall1^CreERR26^Ai14转基因小鼠证实了这一特异性，该小鼠在他莫昔芬处理后，只有小胶质细胞被dTomato标记。c.Sall1依赖的小胶质细胞标记在新型隐球菌感染过程中保持稳定，并保持对该细胞类型的特异性。d-e.研究人员发现，Sall1^CreERCsf1r^flox小鼠在他莫昔芬治疗后，脑内小胶质细胞特异性耗竭，但脑膜巨噬细胞和其他巨噬细胞群数量正常。f.重要的是，这些小胶质细胞特异性敲除小鼠在感染后第3天的脑部真菌负荷显著降低，与研究人员的其他敲除模型一致。在感染后第6天，与野生型同窝对照小鼠相比，小胶质细胞敲除小鼠的真菌脑负荷没有显著差异。g.然而，在Zc15感染的小鼠中，小胶质细胞的缺失并不影响感染的控制。综上，这些结果证实了小胶质细胞对于控制多菌株背景的新生隐球菌感染并没有保护作用。

图4

要点4：a.对感染rdi1∆突变体的小鼠脑组织进行组织学检查，发现在感染后72 h，组织损伤区域主要为胞外酵母，而此时野生型酵母细胞既有胞内又有胞外。b.对这些图像进行量化后发现，在计数的野生型酵母中，有51.9%是细胞内的，而rdi1∆突变体中只有8.6%是细胞内的。c.研究人员用野生型或rdi1∆新型隐球菌感染小胶质细胞充足(未治疗)或小胶质细胞耗竭(PLX5622)的小鼠，然后定量脑部真菌负荷。与野生型新型隐球菌相比，rdi1∆菌株的脑部真菌负荷显著降低。重要的是，当小胶质细胞缺失导致野生型新型隐球菌的脑部感染显著减少时，当感染rdi1Type突变体时，小胶质细胞缺失小鼠和它们的未处理对照之间的脑部真菌负担没有显著差异。这些数据表明，随着小胶质细胞的耗竭而观察到的脑真菌负担的减少依赖于真菌在细胞内存活的能力。

图5

要点5：a.在铜死亡条件下，新生隐球菌上调铜转运蛋白CTR4的表达，这对于真菌在CNS24中的生长和毒力至关重要。b.研究人员通过检测CTR4启动子(新型隐球菌^pCTR4GFP)控制下的GFP转基因表达，比较了胞内酵母细胞(小胶质细胞内)和胞外酵母在脑内的CTR4表达。c-d.研究人员发现胞外酵母上调了^pCTR4GFP的表达，这与之前的数据一致，表明该基因在CNS10中被显著诱导。相反，研究人员发现与小胶质细胞相关的酵母显著降低了^pCTR4GFP表达。e.与胞外酵母相比，胞内酵母中正常的^pCTR4GFP表达量同样降低。总而言之，研究人员的数据表明，新型隐球菌人群在大脑中存在显著的异质性，这可能是由获取营养物质和铜等微量金属所驱动的。

图6

要点6：a.与小胶质细胞内的酵母相比，研究人员发现大脑中巨噬细胞内化的酵母^pCTR4GFP表达增加，几乎与细胞外酵母的水平相同。在招募的单核细胞和中性粒细胞中，细胞内真菌具有不同水平的^pCTR4GFP表达，平均介于小胶质细胞和巨噬细胞之间。b.这些实验表明，与小胶质细胞相比，巨噬细胞产生CXCL9的比例显著增加。c.研究人员用新型隐球菌pCTR4-GFP感染小鼠小胶质细胞系BV-2，比较未经处理的小胶质细胞或经IFNγ预处理的小胶质细胞内^pCTR4GFP的表达。d-e.研究人员发现，经IFNγ处理的小胶质细胞内化的酵母比未经处理的小胶质细胞内化的酵母具有更高的^pCTR4GFP表达。f.研究人员使用成像流式细胞仪重复了这一实验，并独立验证了与未处理相比，IFNγ处理的小胶质细胞中内吞的酵母增加了^pCTR4GFP的表达和强度。这些数据表明，IFNγ诱导小胶质细胞和巨噬细胞吞噬体内的铜限制，从而增强真菌铜饥饿反应。

图7

要点6：a.研究人员发现，与单核细胞和巨噬细胞相比，小胶质细胞具有较低的铁、镁和锌含量，而中性粒细胞则略有不同。b.这些实验表明，在整个感染过程中，脑中的铜含量保持相对稳定，与基线相比没有显著变化，反映了组织中铜水平的严格稳态控制。c.研究人员发现中性粒细胞具有较高的真菌杀灭率和较低的细胞内滞留，因为只有-14%的酵母细胞从这种细胞类型中存活。相比之下，招募的单核细胞具有较高的胞内真菌滞留率，约75%的酵母菌仍然存活。小胶质细胞和巨噬细胞具有相似的真菌驻留率和杀灭能力，在这些细胞类型中，仍有约60%的酵母存活。总之，这些数据表明，中性粒细胞在大脑中具有较高的真菌抑制活性，而巨噬细胞、单核细胞和小胶质细胞具有相似的细胞内真菌生长速率。d.∆ctr1/∆ctr4C.neoformans菌株缺乏两种主要的铜输入源ctr1和ctr4，感染小鼠脑的能力明显降低，可能与该菌株无法输入环境铜而导致生长缺陷有关。重要的是，在缺乏小胶质细胞的小鼠中，∆ctr1/∆ctr4突变体的生长甚至进一步受到限制，这表明需要新生的铜进口商的表达和小胶质细胞的存在来介导脑内的完全毒力和感染。相比之下，一种过表达CTR4的铜不敏感的新生C.不受小胶质细胞缺失的影响，研究人员从野生型和小胶质细胞缺失的小鼠中恢复了类似的真菌负荷。综上所述，这些数据表明，虽然小胶质细胞不需要保护新生假梭菌免受感染，但它们可能以某种方式影响真菌细胞的表型和存活，这部分取决于新生假梭菌清除铜和适应铜限制环境的能力。

全文小结

综上所述，该数据表明小胶质细胞是细胞内真菌感染的重要储存库，可以保护真菌免受中枢神经系统内铜缺乏环境的影响。这是小胶质细胞促进中枢神经系统感染的首个例子之一，为隐球菌性脑膜炎期间大脑中宿主-真菌相互作用的关键途径提供了新的见解。

参考文献：Mohamed, S.H., Fu, M.S., Hain, S. et al. Microglia are not protective against cryptococcal meningitis. Nat Commun 14, 7202 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-43061-0