IF 64.5 CELL│超级增强子促进基因表达的新机制

前言

2023年12月14日，来自英国约翰·拉德克利夫医院的Mira Kassouf和Douglas R.Higgs团队联合在Cell杂志上发表了题为“Super-enhancers include classical enhancers and facilitators to fully activate gene expression”的文章，研究人员以α-globin超级增强子为研究对象，发现这个超级增强子中，辅助元件虽然不具有增强子活性，但能够促进传统增强子的功能，它们能够促进传统增强子对Mediator复合物的招募，促进增强子RNA的转录以及促进增强子和启动子的相互作用。

背景介绍

超级增强子（SE）一般指的是DNA上具有增强子生物学特征的一些元件集合，比如具有高水平的H3K27Ac修饰，能够招募转录因子（TF），招募转录共激活因子如Mediator复合物等。尽管已经对超级增强子有了很深入的研究，但目前研究人员仍旧不清楚，超级增强子仅仅是一些传统增强子的集合，还是这些增强子相互之间具有协同作用。以前通过删除一个或者多个增强子的研究方法得到了许多相互矛盾的结论，因此，更详细和准确的分析对于理解超级增强子的作用具有重要意义。

图文解析

图1

要点1：A.这两个合成等位基因(WT和R2-only)分别使用重组酶介导的基因组替代(RMGR)25整合到mESCs中，其中整个α-珠蛋白位点的一个拷贝已经被删除。因此，合成的半合子细胞只含有一个(合成的)α-珠蛋白等位基因，这使得可以对每个新合成的位点进行特异性的基因组分析。第三个遗传模型是通过使用CRISPR-Cas9方法从R2-only mESCs中删除剩余的R2元件，创建无增强子模型，其中α-SE的所有元件都已从位点上删除(Δα-SE)。然后，研究人员使用基于eb的mESCs体外分化和红细胞纯化系统来分析半合子WT、Δα-SE和R2-only红细胞。B.在删除α-SE的所有五个元素(Δα-SE)后，EB衍生的红细胞几乎完全失去α-珠蛋白的表达(>99.9%的损失)，并且所有通常与SE元素相关的染色质标记都丢失了。非常小的ATAC-seq峰在α-球蛋白启动子上持续存在，但它们不再被GATA1或PolII结合，也不再被H3K4Me3标记。在没有增强子的情况下，H3K27Ac几乎完全从整个基因座中丢失，只剩下一个与胚胎期ζ-珠蛋白基因相关的非常小的峰。总之，Δα-SE模型为研究SE元素在红细胞生成过程中的单独和联合作用提供了一个良好的特征基线。C.出乎意料的是，EB来源的r2细胞仅表达10%的α-珠蛋白，比预测的少5倍。D.因此，研究人员预测R2-only红系细胞将产生50%α-珠蛋白表达。为了进一步研究R2-only表型，研究人员建立了一个R2-only小鼠模型，其中内源性α-SE被含有R2但不含R1,R3,Rm或R4的SE取代。先前ΔR2小鼠α-球蛋白表达降低50%，红细胞参数无明显变化，因此研究人员预测R2-only小鼠将呈现相似的基因表达和血液学表型。

图2

要点2：A.与ΔR2小鼠相比，R2-only小鼠在很大程度上是不存活的。在16个在胚胎期(E)9.5、E10.5、E12.5、E14.5和E17.5收获的杂合子组合中，WT：杂合子：纯合子的孟德尔比例与预期一致；然而，纯合的R2-only胚胎明显比他们的WT和杂合的同窝卵小而苍白。研究人员仅获得1例存活的纯合子，伴有贫血和严重的脾肿大，并在7周内过早死亡。B.为与WT小鼠相比，R2小鼠的红系细胞仅表达15%的α-珠蛋白，而不是预测的50%。C.对3只R2和2只WT幼崽的FL红系细胞进行Poly-A-minus RNA测序，证实了RT-qPCR结果，表明R2幼崽的FL红系细胞中各种红系和发育标志物的表达不受影响。有趣的是，含有4个α-SE元素的Nprl3基因的稳态RNA水平在R2型红细胞中似乎不受影响。然而，从启动子开始的新生表达分析可能会受到α-SE的影响。α-珠蛋白位点上游的两个基因也出现下调;Snrnp25和Mpg基因是管家基因，似乎只在红细胞中受到影响，这将它们在R2纯合子小鼠中的下调与缺陷的α-球蛋白红细胞特异性增强子簇联系起来。

图3

要点3：A.ATAC-seq显示，R2和α-珠蛋白启动子在R2-onlyFL红系细胞中仍然可达，当R2-onlyFL红系细胞数据与WT数据进行比较时，R1,R3,Rm和R4是迄今为止全基因组范围内差异最大的可达区域。B.红细胞特异性转录因子(例如,Gata1和Nf-e2)在R2-only和WTFL红系细胞中同时占据R2和α-珠蛋白启动子的程度相当。研究人员推断，在α-SE中没有其他元件的情况下，R2保留了其增强子的身份，招募转录因子并形成开放的染色质区域。

图4

要点4：A.为了定量比较WT和R2-only细胞中R2e RNA的转录，研究人员进行了"虚拟qPCR"，将R2e RNA的水平标准化为eRNA，eRNA来源于β-珠蛋白HS2增强子，β-珠蛋白基因座控制区(LCR)的成员和特征良好的SE。这表明，与WT相比，R2-only细胞中R2eRNA的转录减少了3倍。B.染色质相互作用热图显示，在R2-only FL红系细胞中，在整个α-珠蛋白亚TAD中，成对相互作用的总体频率降低。C.除了从WT和R2-only红系细胞生成虚拟捕获图外，研究人员还重新分析了先前发表的WTmESC tied-c数据，以作为非红系对照。每个CTCF位点(位点上游的HS38和HS29和下游的HS48)与周围DNA之间的染色质相互作用在R2-only FL红系细胞中未受干扰，表明在缺乏R1,R3,Rm和R4元件的情况下仍然形成65kbα-球蛋白亚tad。然而，对R2的染色质相互作用谱的研究显示，R2与α-珠蛋白启动子之间的相互作用频率显著降低，这一点被启动子本身的互虚捕获所证实。尽管这些相互作用的频率在r2-FL红系细胞中减少，但仍显著高于WT-mESC基线。

图5

要点5：A.对EB来源的红细胞染色质可及性和α-珠蛋白基因表达的分析与研究人员之前的发现完全一致。B.R3、Rm和R4元素表现出很少或没有固有的传统增强子活性，但它们似乎仍然是充分α-SE活性所必需的。研究人员称这些元素为“促进者”。为了研究R3,Rm和R4如何补充R1和R2的活性，研究人员创建了一个“增强子滴定系列”，依次从缺乏R1R2-only模型重建原生α-SE到WT，并生成所有R3/Rm/R4排列。C.使用ATAC-seq，研究人员显示在每个模型中，与适当元件相关的染色质在红系细胞中变得可及，并且在整个位点的其余部分中，可及性没有意外的变化。D.R4元件的重新插入伴随着H3K27Ac比R1和R2元件的大量增加，这表明R4的主要作用是促进两种经典增强子的充分活性。

图6

要点6：A.为了探究R4具有优异拯救潜力的原因，研究人员重新分析了一个现有的DNase-seq数据集，并对5个α-SE元件进行了FIMO(MEME-suite)模体分析。令人惊讶的是，R1和R2含有最高密度的TF模体和最复杂的DNase足印信号。然而，基序分析显示R3比Rm和R4组合含有更多的红系TF基序(通过绝对数和模体多样性)，这与R3比Rm和R4具有更丰富的DNase足印信号相佐证。B.EB衍生的R2R4[R1]红细胞仅表达12%的α-珠蛋白，与R2衍生的红细胞表达水平相当，这表明R4的拯救能力并不完全取决于其序列。C.接下来，为了测试元件定位的重要性，研究人员修改了R1R2-only模型，在R4的位置插入R3(R1R2R3[R4])，并在重新插入位点显示了可访问的染色质。在该模型中，将R3移向α-珠蛋白启动子具有显著的效果，与仅R1R2驱动的R1R2模型。总之，这有力地表明R4的位置，而不是它的序列，支撑着它在拯救基因表达方面的效力。D.为了测试是否可以通过简单地减少R2与其同源启动子之间的线性距离来挽救R2-only转录缺陷，研究人员修改了Δα-SE模型，在R4的位置插入R2(R2[R4])，并在重新插入位点显示了可访问的染色质。令人惊讶的是，将R2移向α-珠蛋白启动子并没有对基因表达产生积极影响。这表明R2与α-珠蛋白启动子的物理线性接近不足以恢复R2的全部活性。

全文小结

综上所述，本研究通过基因工程的方法构建了一系列SE的突变体，在小鼠胚胎干细胞中检测了SE的不同元件对靶基因的表达调控。本研究揭示了一些对超级增强子不同元件的新的认识，发现辅助元件能够促进传统增强子的作用，共同调控靶基因的表达以及表观遗传修饰。

参考文献：Blayney JW, Francis H, Rampasekova A, Camellato B, Mitchell L, Stolper R, Cornell L, Babbs C, Boeke JD, Higgs DR, Kassouf M. Super-enhancers include classical enhancers and facilitators to fully activate gene expression. Cell. 2023 Dec 21;186(26):5826-5839.e18. doi: 10.1016/j.cell.2023.11.030. Epub 2023 Dec 14. PMID: 38101409.

https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.11.030