IF 9.587Journal of Neuroinflammation│急性呼吸窘迫综合征患者的胃肠道微生物群诱导小鼠神经炎症和认知障碍前言： 2023年7月15日，温州医科大学药学院瓯江实验室高洪昌教授团队在Journal of Neuroinflammation发表题为“Gastrointestinal microbiome of ARDS patients induces neuroinflammation and cognitive impairment in mice”的研究论文。研究发现了微生物群-肠道-脑之间的相互作用在ARDS/CAP相关的行为障碍中的作用，并建议在临床实践中将肠道微生物群作为保护ARDS患者脑健康的潜在靶点。
背景介绍： 急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种由非心源性肺水肿引起的呼吸衰竭综合征，导致高死亡率和经济负担。ARDS常发生在患有肺炎、败血症、严重创伤和COVID-19的患者身上，甚至有十分之一的患者在重症监护病房发展为ARDS。特别值得注意的是，ARDS可能导致一系列并发症，如抑郁、焦虑、重症肌无力、纤维化、肺功能下降、创伤后应激障碍和行走功能障碍。此外，认知障碍和记忆丧失也被认为是ARDS相关并发症，可能归因于炎症、缺氧和血脑屏障破坏。ARDS对脑健康的影响越来越受到关注，但可能的发病机制仍需要进一步探索。肠道微生物群与ARDS的发病和进展有关。研究表明，肠道微生物群可以介导肠脑相互作用并影响脑功能。因此，研究人员假设ARDS微生物群也可能通过肠脑轴影响脑健康。 图文解析：
图1 要点1： 在本研究中，从研究人员大学附属医院招募了21名ARDS/CAP患者和21名健康对照组（CTRL）。ARDS/CAP组和CTRL组之间的性别和年龄没有显著差异。值得注意的是，ARDS/CAP患者的降钙素原、C-反应蛋白和IL-6水平显著增高，远超正常范围，表明存在高度炎症反应。然而，ARDS/CAP患者的IL-2、IL-4和TNF-α水平仍在正常范围内。然后，通过16S rRNA测序分析j检测了ARDS/CAP患者粪便样本中肠道微生物群的特征。 a-d.结果显示，与CTRL组相比，ARDS/CAP患者的chao1和观察到的物种水平显著增高，而Shannon和Simpson指数较低。这些结果表明，ARDS/CAP患者的物种总数增加，但物种多样性减少。 e.ARDS/CAP患者的肠道微生物群在门的水平上发生了改变。 f.(Bacteroidota+ Proteobacteria)/Firmicutes的比例（(B+F)/F）在ARDS/CAP患者中高于CTRL组（p=0.06），表明ARDS/CAP患者的革兰氏阴性菌丰度增加。 g.基于肠道微生物群属水平的PCoA分析清晰地将ARDS/CAP组与CTRL组分开，表明ARDS/CAP患者的微生物模式与CTRL组有所不同。 h.i.随后，采用火山图分析确定了在ARDS/CAP组和CTRL组之间显著变化的关键肠道微生物，并以热图的形式呈现。总共鉴定出144种肠道微生物，与CTRL组相比，其中111种（77.08%）肠道微生物在ARDS/CAP患者中显著增加。研究人员还发现，ARDS/CAP患者中有39种革兰氏阴性菌富集，其中29种（93.55%）属于变形菌门，10种（83.33%）属于拟杆菌门。综上所述，结果表明，ARDS/CAP患者的肠道微生物群发生了显著变化，尤其是革兰氏阴性菌丰度增加。
图2 要点2： a.为了研究ARDS/CAP微生物群对脑健康的影响，本研究将来自ARDS/CAP患者或CTRL组的粪便微生物群每天转移给经过抗生素处理的雄性小鼠，连续进行4周，分别命名为ARDS-R和CTRL-R。 b.c.与CTRL-R小鼠相比，ARDS-R小鼠的肠道微生物群在门的水平上发生了改变，其中(B+F)/F比例在ARDS-R小鼠中显著增高，暗示ARDS/CAP患者中增加的革兰氏阴性菌被转移到了受体小鼠体内。 d.基于属水平的PCoA分析显示，ARDS-R小鼠与CTRL-R小鼠在微生物模式上存在明显差异，如图所示。 e.然后，通过火山图分析确定了ARDS-R小鼠和CTRL-R小鼠之间显著变化的肠道微生物，并在图中呈现。 f.结果显示，与CTRL-R小鼠相比，ARDS-R小鼠的Eubacterium、Barnesiella、Escherichia-Shigella和Lactobacillus丰度显著增加，而Muribaculum、Ruminococcaceae_NK4A214 _group和Blautia的丰度显著降低。其中，ARDS/CAP患者中Eubacterium、Barnesiella、Escherichia-Shigella和Lactobacillus的丰度增加被转移到了受体小鼠体内。
图3 要点3： 为了研究ARDS/CAP微生物群对肠道的影响，研究人员分析了小鼠结肠的形态、炎症和紧密连接蛋白。 a-c.研究人员发现，相对于对照组小鼠，ARDS-R小鼠的小肠腺体长度和腺细胞数目显著减少，表明接受ARDS/CAP微生物群的小鼠肠道内稳态受到破坏。 h.i.相对于对照组小鼠，ARDS-R小鼠结肠中ZO-1和occludin的mRNA表达水平显著降低。 d-g.此外，免疫荧光分析证实，相对于对照组小鼠，ARDS-R小鼠的ZO-1和occludin蛋白水平显著降低。这些结果表明，接受ARDS/CAP微生物群的小鼠结肠屏障完整性受损。 j-l.此外，ARDS/CAP微生物群也可能促进小鼠结肠的炎症反应，如图所示，IL-6、TNF-α和IL-1β的水平显著增加。与对照组小鼠相比，ARDS-R小鼠的血清内毒素（LPS）显著增加，这可能是由于肠道屏障通透性增加。这一发现与ARDS/CAP患者的临床结果相符，表明肠道通透性指标，如DAO（二胺氧化酶，p=0.001）和LPS（p=0.015）的水平显著增加。LPS已被认为是从肠道微生物群产生的关键促炎产物，导致ARDS-R小鼠肺部有炎症浸润和M1巨噬细胞激活，分别观察到了HE染色和F4/80免疫染色。此外，研究人员还检测到ARDS-R小鼠肺部IL-6和TNF-α的水平显著增高。ELISA检测显示，相对于对照组小鼠，ARDS-R小鼠的血清中IL-6和TNF-α显著增加。综上所述，研究人员的结果表明，来自ARDS/CAP患者的肠道微生物群可能通过破坏结肠屏障完整性和增加内毒素通量来促进炎症反应。
图4 要点4： a-b.在这项研究中，研究人员发现相对于对照组小鼠，ARDS-R小鼠的皮质中ZO-1和occludin的mRNA表达水平显著降低。 c.d.在海马中，ARDS-R小鼠的ZO-1水平低于对照组小鼠，而occludin水平在两组之间没有显著差异。这些结果表明，ARDS/CAP微生物群可能破坏了血脑屏障的完整性。 e.然后，使用Iba-1染色检查了ARDS-R小鼠的皮质和海马中激活的小胶质细胞的密度，并在图中给出了代表性的Iba-1染色图像。 f-i.定量结果显示，相对于对照组小鼠，ARDS-R小鼠的皮质和海马包括C1、C3和DG区域的Iba-1阳性细胞数目显著增加。 j-o.此外，激活的小胶质细胞释放的促炎细胞因子（包括IL-1β、IL-6和TNF-α）的mRNA表达水平在ARDS-R小鼠的皮质和海马中也显著高于对照组小鼠。研究人员使用GFAP和NeuN免疫荧光染色检查了皮质和海马中星形胶质细胞和神经元的数目。相应的定量结果显示，相对于对照组小鼠，ARDS-R小鼠的皮质和海马包括C1、C3和DG区域的GFAP阳性细胞数目显著增加。然而，相对于对照组小鼠，ARDS-R小鼠的皮质和海马C1、C3和DG的NeuN阳性细胞数目显著减少。综上所述，ARDS/CAP微生物群可能导致小胶质细胞激活和星形胶质细胞增殖，引发神经炎症和神经元丢失。
图5 要点5： 为了评估ARDS/CAP微生物群对小鼠行为功能的影响，研究人员进行了开放式场地测试（OFT）、莫里斯水迷宫（MWM）和Y迷宫测试（YMT）。 a-d.从OFT期间CTRL-R和ARDS-R小鼠的典型运动轨迹，可以看出ARDS-R小鼠在中央区域的距离百分比（p<0.05）和时间百分比（p=0.053）以及总距离（p=0.054）均较低。因此，OFT结果表明ARDS-R小鼠表现出焦虑样行为。 e.MWM结果显示，训练期间ARDS-R小鼠的逃避潜伏期显著长于CTRL-R小鼠，表明ARDS-R小鼠的学习能力受损。 f.随后，在训练后的第5天移除逃生平台以测试记忆能力，图中给出了CTRL-R和ARDS-R小鼠的典型游泳轨迹。 g-i.研究人员发现，相对于CTRL-R小鼠，ARDS-R小鼠的记忆能力受损，表现为逃生平台频率的显著降低以及在目标区域的距离百分比和时间百分比的显著降低。 j.k.此外，与CTRL-R小鼠相比，ARDS-R小鼠的YMT自发交替行为显著减少，而总交替行为没有显著变化。这一发现表明，ARDS-R小鼠的空间工作记忆和参考记忆受损。因此，研究结果表明，ARDS/CAP微生物群可能导致小鼠的行为障碍。
图6 要点6： 为了进一步探究肠道微生物群、宿主炎症和行为指标之间的关联，进行了相关网络分析。 a.如图展示了与|R|>0.30且p<0.05的相关性，可以看到复杂的微生物群-肠道-脑相互作用。结果揭示了小鼠行为变化与肠道微生物群、结肠屏障功能和宿主炎症密切相关。例如，在MWM中，目标区域（DG）的距离百分比与皮质ZO-1和occludin水平呈正相关，但与皮质IL-1β和肠道微生物群Escherichia-Shigella和Lactobacillus呈负相关。ARDS-R小鼠MWM中目标区域（TG）的时间百分比降低与皮质occludin和Blautia的减少以及结肠IL-6和Escherichia-Shigella的增加有关。海马TNF-α与MWM中逃生平台频率（PF）和YMT中自发交替（SA）呈负相关。OFT中中央区域（DC）的距离百分比与皮质occludin呈正相关，但与海马IL-6和结肠ZO-1呈负相关。此外，研究发现OFT中的总距离（TD）与皮质TNF-α呈负相关，与皮质occludin和海马ZO-1呈正相关。 本文小结： 综上所述，研究结果表明ARDS/CAP患者的肠道微生物群可以通过肠脑轴诱导小鼠的神经炎症和行为障碍。一方面，革兰氏阴性菌的富集产生更多的内毒素（LPS），从而促进炎症反应。另一方面，肠道和脑的渗漏可以加速LPS进入循环，导致全身性炎症、脑部疾病，最终引发行为功能障碍。因此，在临床实践中，研究人员建议针对肠道微生物群和肠道渗漏进行干预可能是预防和治疗ARDS/CAP相关行为障碍的一种有前景的策略。 参考文献： Zheng H, Zhao Q, Chen J, Lu J, Li Y, Gao H. Gastrointestinal microbiome of ARDS patients induces neuroinflammation and cognitive impairment in mice. J Neuroinflammation. 2023 Jul 15;20(1):166. doi: 10.1186/s12974-023-02825-7. PMID: 37454113; PMCID: PMC10349492. https://doi.org/10.1186/s12974-023-02825-7 |
