IF11.4 Redox Biology│RVLM 环状RNA Galntl6通过miR-335/Lig3轴调控应激性高血压机制

前言：

2023年6月9日，中国中医科学院分子医学国际合作实验室、上海大学生命科学学院、菏泽学院农业与生物工程学院及绍兴上海大学研究院联合在Redox Biology发表“CircRNA Galntl6 sponges miR-335 to ameliorate stress-induced hypertension through upregulating Lig3 in rostral ventrolateral medulla”的研究论文。研究发现，circRNA Galntl6直接靶向微小RNA-335(miR-335)并对其进行抑制，减少氧化应激。miR-335的重新引入显著逆转了circRNA Galntl6诱导的氧化应激的减弱。此外，Lig3可以作为miR-335的直接靶基因。抑制miR-335可显著增加Lig3的表达并抑制氧化应激，而这些有利作用可被Lig3敲低所阻断。circRNA Galntl6是阻碍SIH发生发展的新因子，circRNA Galntl6/miR-335/Lig3轴是其可能的作用机制之一。这些发现表明circRNA Galntl6可能是预防SIH的有用靶点。

背景介绍：

环状RNA(circular RNAs，circRNAs)是一类不含5′帽子和3′尾巴的非编码RNA (non-coding RNA，ncRNAs)，在多种病理和生理过程中发挥重要的调控作用。许多外周circRNA，如circRNA 0016070、circRNA抗衰老酶1和circRNA 0014243，在高血压发生发展中至关重要。然而，关于心血管中枢circRNA谱的表征及其在交感神经流出和BP（blood pressure）中的功能研究尚未见报道。迄今为止，尚未有研究明确circRNAs在RVLM（rostral ventrolateral medulla）中的表达模式并确定其调控作用。在本研究中，通过RNA测序分析从SIH（stress-induced hypertension）和对照组大鼠分离的RVLM组织，鉴定了数千种不同的circRNA，结果表明circRNA Galntl6在SIH大鼠中的表达显著下调。揭示了circRNA Galntl6过表达对氧化应激、神经元兴奋性、交感神经放电和BP的影响。是否为circRNA确定Galntl6是miR-335靶向Lig3的海绵。此外，还阐明了miR-335和circRNA Galntl6或Lig3对氧化应激和SIH进展的影响。

图文解析：

图1

要点1

A.采用RNA测序法比较两组间RVLM。测序及质控后共获得501，346，052条clean reads，其中SIH组254，254，380条，对照组247，091，672条。总共组装了12,242个circRNA转录本，并进行了进一步的分析。结果显示，circRNA差异表达的基因有32个（p值<0.05）。通过热图(Heatmap)标记前五位差异表达的circRNA。

B-C.RT-qPCR结果显示，3个circRNA(circRNA Galntl6、circRNA Acaca和circRNA Sorbs1)的表达模式与RNA测序结果非常一致。与对照组大鼠相比，SIH大鼠circRNA Galntl6的表达显著降低，且在RVLM组织中大量表达。

D.使用RNase R验证circRNA Galntl6的稳定性。结果表明，circRNA Galntl6不受RNase R的影响，而Galntl6 mRNA被RNase R消化。

E.此外，通过Sanger测序验证了circRNA Galntl6的RT-PCR产物中存在头尾相接的剪接。

F. FISH和RT-qPCR结果显示circRNAGalntl6主要定位于细胞质。

图2

要点2：

A.无线电遥测显示，过表达circRNA Galntl6显著降低了SIH大鼠的MAP和HR水平。

B-C.通过RSNA记录实验和血浆NE ELISA实验检测交感神经流出，结果表明circRNA Galntl6上调后RSNA和血浆NE值显著降低。

D.通过免疫荧光实验进一步揭示了circRNA Galntl6对神经元兴奋性的影响。结果显示，circRNA Galntl6过表达显著降低了SIH大鼠RVLM内c-Fos阳性TH +神经元的比例。以上结果表明，circRNA Galntl6可减轻神经元兴奋性，抑制交感神经张力，参与SIH的神经源性调节。

图3

要点3：

A.RVLM内氧化应激损伤增强交感血管舒缩张力，促进高血压的发生。在SIH大鼠RVLM微量注射pLV-circRNA Galntl6质粒后，检测RVLM内8-OH -dG水平。circRNA Galntl6过表达组8-OH-dG水平显著降低。

B-C.RVLM中circRNA Galntl6的上调显著提高了SOD和CAT的活性。

D.与SIH和SIH + pLV-NC组大鼠相比，SIH+pLV-circRNA Galntl6组大鼠RVLM内ROS生成明显减少。这些发现表明circRNA Galntl6抑制氧化应激RVLM抑制交感神经过度兴奋对抗SIH。

图4

要点4：

A.RNAhybrid生物信息学预测显示circRNA Galntl6存在miR-335的结合位点。

B.在circRNA存在的B104细胞中，使用生物素化的miR-335 agomir或生物素化的agomir NC下调circRNA Galntl6过表达Galntl6，结果显示circRNA Galntl6主要富集在生物素化的miR-335 agomir组中。

C.用含有包含miR-335预测位点的circRNA Galntl6序列的荧光素酶质粒进行报告实验，circ RNA的荧光素酶活性miR-335过表达显著降低了Galntl6-WT，而circRNA Galntl6-MUT的荧光素酶活性无明显变化。

D-E.在B104细胞中高效过表达或抑制circRNA Galntl6的表达，结果表明过表达或敲低circRNA Galntl6可负调控miR-335的表达。

F.进一步在体内验证了这种调控关系，结果表明在RVLM中过表达circRNA Galntl6显著降低了miR-335的表达。以上结果证明circRNA Galntl6可以直接海绵吸附miR-335。

图5

要点5：

A. MiR-335 agomir减弱了circRNA Galntl6过表达对SIH大鼠RVLM内8-OH-dG水平的抑制作用。

B-C. RVLM微量注射miR-335 agomir后，circRNA Galntl6过表达对SOD和CAT活性的促进作用被逆转。

D. miR-335 agomir削弱了circRNA Galntl6过表达对SIH大鼠RVLM内ROS产生的抑制作用。总之，这些结果表明circRNA Galntl6调控miR-335影响RVLM氧化应激，参与SIH发病。

图6

要点6：

A. Target Scan和miRanda工具预测miR-335可能直接靶向Lig3。

B.双荧光素酶报告基因实验结果证实，agomir上调B104细胞中miR-335的表达显著降低Lig3-WT-3′UTR报告基因的荧光素酶活性，而对Lig3-MUT-3′UTR报告基因的荧光素酶活性无显著影响。

C-D.当miR-335过表达时，Lig3的mRNA和蛋白水平显著降低。相反，miR-335敲低导致Lig3表达显著增加。

E.结果显示，在RVLM中下调miR-335显著增加Lig3的表达。这些观察结果证明miR-335靶向Lig3。

图7

要点7：

A.miR-335敲低降低了SIH大鼠RVLM中8-OH-dG的水平，而Lig3抑制则减弱了这种影响。

B-C.mi R335下调后，细胞内SOD和CAT活性升高SIH大鼠RVLM在Lig3抑制后有所恢复。

D.miR335拮抗剂降低了SIH大鼠RVLM内ROS的生成。然而，Lig3敲低阻碍了这种作用。总之，这些发现表明miR-335通过靶向Lig3调节RVLM的氧化应激，在SIH进展中发挥关键作用。

图8

要点8：

A-D.miR-335被circRNA Galntl6所海绵化，Lig3是miR-335的靶基因。因此，circRNA Galntl6是否通过靶向miR-335调控Lig3的表达被进一步揭示。RT-qPCR和Western blot结果显示，在B104细胞中，circRNA Galntl6过表达或沉默均可显著上调或下调Lig3的mRNA和蛋白水平，而miR-335 agomir或同型替代抗体可逆转这些效应。

E-F.体内实验显示SIH + pLVcircRNA Galntl6大鼠RVLM中Lig3的表达显著增加。然而，miR-335 agomir给药显著阻止了的增加。综上所述，这些数据证明circRNA Galntl6可以通过吸附miR-335来调节Lig3的表达。

本文小结：

综上所述，通过对SIH和对照组大鼠的RVLM组织进行RNA测序，鉴定出了数千种不同的circRNAs，并且结果显示SIH大鼠中circRNA Galntl6的表达显著下调。揭示了circRNA Galntl6过表达对氧化应激、神经元兴奋性、交感神经放电和血压的影响。确定了circRNA Galntl6是否是miR-335靶向Lig3的海绵。此外，还阐述了miR-335和circRNA Galntl6或Lig3对氧化应激和SIH进程的影响。

参考文献：

Zhang S, Wang X, Chen G, Tong L, Dai T, Wang L, Zhu L, Zhang H, Du D. CircRNA Galntl6 sponges miR-335 to ameliorate stress-induced hypertension through upregulating Lig3 in rostral ventrolateral medulla. Redox Biol. 2023 Aug;64:102782.   

https://doi.org/10.1016/j.redox.2023.102782