IF6.1 Neural Regeneration Research│TUG-891减轻脑室出血后神经元焦亡机制

前言：

2023年8月9日，四川大学华西医院神经外科、重庆市第一附属医院神经外科、中国四川省成都市第二人民医院神经外科、四川省南充市川北医学院医院附属神经外科、四川大学华西临床医学院生物治疗国家重点实验室联合在Neural Regeneration Research发表题为“TUG-891 inhibits neuronal endoplasmic reticulum stress and pyroptosis activation and protects neurons in a mouse model of intraventricular hemorrhage”的研究论文。研究发现，研究人员建立的一种小鼠脑室内出血模型，并在大脑组织中发现了焦亡和内质网应激。腹腔注射选择性GPR120激动剂TUG-891抑制了内质网应激，焦亡和炎症，并保护了神经元。TUG-891的神经保护作用似乎与抑制内质网应激和焦亡激活有关。

背景介绍：

脑室内出血（IVH）是一种常见的严重疾病，分为原发性和继发性，以高死亡率和残疾率和预后差为特征。然而，这些糟糕的结果的原因复杂且不完全被理解。非凋亡性炎症细胞死亡在创伤性脑损伤和出血性中风研究中引起了关注。经典的炎症性细胞死亡途径以NLRP3（nucleotide-binding oligomerization domain and leucine-rich repeat pyrin domain-containing protein 3）炎症小体为特征，在出血性中风中起着重要作用。在经典的焦亡途径中，NLRP3炎症小体的激活产生裂解的半胱天冬酶-1，这种酶裂解气胸蛋白D（GSDMD）以释放GSDMD的N-末端领域。GSDMD的N-末端领域位于细胞膜上，并聚集成孔。此外，caspase-1裂解前白细胞素（IL）-1β和前IL-18形成成熟的IL-1β和IL-18，这些细胞素通过膜孔分泌出来，然后发生炎症和凋亡。通过AC-TYR-VAL-ALA-ASP-CMK（AC-YVAD-CMK）选择性地抑制caspase-1可以减少胶原酶诱导的小鼠脑内出血模型中的脑损伤，这显示了焦亡在神经系统损伤机制中的重要性。NLRP3炎症小体的激活与错误折叠的蛋白质聚集有关。内质网是细胞中负责蛋白质组装和折叠的细胞器。在压力条件下，内质网遇到错误折叠和未折叠的蛋白质聚集，然后诱导未折叠蛋白质反应（UPR）和内质网应激；持续或过度的内质网应激可以导致细胞损伤甚至死亡。内质网应激信号主要由三种效应蛋白启动：蛋白激酶RNA样内质网激酶、肌醇需求蛋白-1（IRE1）和激活转录因子-6（ATF6）。这三种跨膜蛋白质传感器负责在UPR期间恢复内部环境稳定性，并通过结合免疫球蛋白结合蛋白（Bip）保持不活动状态。然而，在内质网应激或UPR期间，Bip从效应蛋白中分离出来，导致下游蛋白质的顺序激活。内质网应激有可能在某些模型中诱导焦亡。然而，很少有研究检查内质网应激和IVH中的焦亡。

图文解析：

图1

要点1：

在四个实验中将小鼠随机分配到多个组。

实验1.为了研究IVH对小鼠的影响，测量IVH组(n=3)和假手术组(n=3)诱导后18、36、54和72小时的体重，并进行了磁共振成像(MRI)检查以确保IVH诱导成功。诱导后3d，采用苏木精-伊红(HE)和尼氏染色法检查脑切片，探讨IVH的组织病理学作用。

实验2.在IVH诱导后18、36、54和72小时(n=6)，使用western blot分析海马NLRP3、GSDMD、IL-1β、含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和caspase-1的表达。根据western blot结果，在研究的其余时间点使用神经元焦亡最明显的时间点。为了探索焦亡的细胞定位，在IVH后36和72小时分别对GSDMD、IL-1β、NLRP3和与神经元特异性核蛋白(NeuN)共表达的caspase-1进行了免疫荧光染色(n=6)，并对相同的蛋白进行了免疫组织化学染色(n=3)。免疫组化n=3例)接受假手术。

实验3.为评价GPR120选择性激动剂TUG-891对内质网应激的影响，将小鼠随机分为4组(n=6):假手术、IVH、IVH+二甲亚砜(DMSO)和IVH+TUG-891。为了评估内质网应激相关蛋白CCAAT增强结合蛋白同源蛋白(CHOP)、环AMP依赖性转录因子-4(ATF-4)、Bip和IRE1α的表达，在IVH后72小时进行western blot。海马进行CHOP和ATF-4免疫荧光染色。计算同侧海马齿状回(DG)平均阳性细胞数(400倍放大)和细胞总数(n=3)。为了评估TUG-891对神经元焦凋亡的影响，在IVH后72小时进行免疫荧光染色和western blotting。海马组织行GSDMD和NLRP3免疫荧光染色。计算同侧海马DG平均阳性细胞数(400倍放大)和细胞总数(n=3)。

实验4.为了评估TUG-891的神经保护作用，观察并评估了运动功能。小鼠随机分为4组(n=6):假手术组、IVH组、IVH+载药组、IVH+TUG-891组。采用吊丝试验评估IVH后3天各组小鼠的握力和耐力。还测定了神经功能缺陷评分,造模3天后定量测定脑水含量。

图2

要点2：

A.在不同的时间点，IVH组的体重低于假手术组，显示了IVH诱导的损害效果。

B-C.大脑组织切片和7.0T MRI显示IVH后侧脑室的扩大。

D.Nissl染色显示，IVH组存活神经元的数量低于假手术组。

E.HE染色揭示了IVH组的脑室扩大、脉络丛损伤、侧脑室区域的室管膜纤毛破坏以及海马细胞体萎缩和核边缘聚集。

F.GSDMD的表达在IVH组中高于假手术组，证明IVH诱导了GSDMD的激活并促进了焦亡。

图3

要点3：

A-F.IVH后，海马中GSDMD、ASC、NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达在IVH组中高于假手术组；大多数蛋白在72小时达到峰值。同样，免疫荧光染色显示GSDMD和NLRP3与神经元共定位。

G-J.在DG区域，GSDMD和NLRP3阳性神经元的百分比在72小时（P＜0.001）和24小时（P＜0.05）时，IVH组显著高于假手术组。根据研究人员的实验结果，确定IVH后72小时为神经元焦亡的时间点。

图4

要点4：

A-E.蛋白印迹结果显示，假手术组、IVH+TUG-891组、IVH+DMOS组和IVH组在IVH后72小时的内质网应激蛋白表达在IVH组中较高，而TUG-891能够抑制其表达。

F-I.双免疫荧光染色显示，DG区ATF-4和CHOP阳性神经元的百分比在IVH组中高于假手术组（P<0.001），而TUG-891能够减轻这些变化（CHOP的P<0.05，ATF-4的P<0.01）。这些发现证明了TUG-891有效抑制内质网应激。

图5

要点5：

A-F.IVH后72小时内，假手术组、IVH+TUG-891组、IVH+DMSO组和IVH组的蛋白质印迹结果显示，TUG-891抑制了焦亡蛋白GSDMD、ACS、NLPR3、caspase-1和IL-1β的表达。

G-J.双免疫荧光染色显示，预先使用TUG-891处理的小鼠中，NLRP3（P<0.001）和GSDMD阳性神经元的比例较低，这证实了TUG-891抑制神经元焦亡。

图6

要点6：

A.TUG-891并未影响IVH后的体重减少。

B.纹状体水分含量在IVH组中高于假手术组（P<0.001）。IVH+TUG-891组的纹状体水分含量显著低于IVH组（P<0.001）。

C-D.假手术组、IVH+TUG-891组、IVH+DMSO组和IVH组的神经功能缺损评估和悬线试验结果显示，TUG-891显著逆转了IVH小鼠的神经功能缺损（P<0.05），并且TUG-891组的小鼠在悬线上停留的时间更长（P<0.05）。IVH+DMSO组和IVH组之间的这些评估并无显著差异。

本文小结：

综上所述，研究结果表明GPR120激动剂TUG-891通过减少内质网应激和神经元的焦亡，降低炎症介质的释放，对IVH的小鼠模型产生神经保护作用。IVH激活内质网应激-NLRP3-焦亡信号通路，导致可以通过TUG-891治疗逆转的脑损伤。GPR120可能是治疗IVH的治疗靶点。

参考文献：

Wang HX, Liu C, Li YY, Cao Y, Zhao L, Zhao YJ, Deng ZA, Tong AP, Zhou LX. TUG-891 inhibits neuronal endoplasmic reticulum stress and pyroptosis activation and protects neurons in a mouse model of intraventricular hemorrhage. Neural Regen Res. 2023 Oct;18(10):2278-2284. doi: 10.4103/1673-5374.369116.

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37056148/