IF13.6 Science Advances|可注射光固化Janus水凝胶递送hiPSC心肌细胞衍生外泌体

IF13.6 Science Advances|可注射光固化Janus水凝胶递送hiPSC心肌细胞衍生外泌体，用于减少心脏手术后粘连可注射光固化Janus水凝胶递送hiPSC心肌细胞衍生外体用于心脏手术后粘连减少

前言：

2023年8月4日。南方医科大学吴耀彬、Caiwen Ou和Wenhua Huang等研究人员在Science Advances杂志上在线发表了题为“Injectable photocurable Janus hydrogel delivering hiPSC cardiomyocyte-derived exosome for post–heart surgery adhesion reduction”的研究性论文。该研究表明，iCM-EXOs通过抑制转录因子Nrf2的激活，有效减轻过氧化氢处理的原代心肌细胞的氧化应激。

背景介绍：

在心脏手术中，手术创伤心外膜可导致术后心包粘连，这是心外膜和胸腔之间的纤维连接。这些粘连大大延长了体外循环时间和总手术时间，并使重做心脏手术的死亡率比初次心脏手术增加了三倍。对于患有先天性心脏病的儿童患者，大约33%的儿科和先天性心脏手术需要重做心脏手术。同样，至少12%接受瓣膜置换术、机械循环支持、或体外循环移植也需要重做心脏手术。然而，术后心包粘连的分子机制尚未完全阐明。然而，以往的临床研究表明，心脏手术常导致出血和心包积液渗出，从而增强氧化应激，诱发心包间隙内的炎症反应。这些因素被认为是造成粘附表型易感性的因素。最近的研究已经探索了类似于黏附水凝胶作为术后心包粘附屏障。它们可以牢固地附着在潮湿的组织表面。不幸的是，当它们的一个表面可能附着在目标组织上时，另一个表面也可能同时附着在非目标组织上。因此，一种能够牢固粘附靶组织而不粘附非靶组织的水凝胶具有重要的临床意义。Janus水凝胶由于具有不对称黏附性而引起了大量的研究关注。它们在腹壁和胃穿孔处表现出抗粘连效果。最近报道了一种Janus水凝胶，命名为HAD[hyaluronic acid–g-(2-aminoethyl methacrylate hydrochloride–dopamine)]。它能有效防止术后腹部粘连。HAD水凝胶的一面粘附在湿组织上，而另一面则抵抗组织粘附。

图文解析：

图1

要点1：

A.HAD+EXOs水凝胶预防心脏术后心包粘连示意图。出血、心包液渗出、氧化应激和炎症反应与术后严重的心包粘连有关。以前的研究应用水凝胶或膜屏障止血或心包液渗出。然而，这些方式未能减少氧化应激和炎症反应。B.利用DA中的儿茶酚基团制造了一种可注射的、光固化的Janus HAD水凝胶，具有不对称粘连和持续释放hiPSC心肌细胞来源的外泌体的能力，减轻氧化应激和炎症反应。通过这种方式，HAD和外泌体协同预防或减轻术后心包粘连。

图2

要点2：

A.HAD前体是根据之前报道的方法通过将盐酸多巴胺(DA)和甲基丙烯酸2-氨基乙酯(AEMA)接到透明质酸(HA)链上合成的。选择透明质酸作为主链是因为这种多阴离子配体在临床应用中广泛用作抗粘附屏障。HA分别被赋予粘接基团(DA)和光固化基团(AEMA)，使其具有粘附性和光交联功能。通过在HA聚合物上AEMA基团合成Hyaluronic acid–g-(2-aminoethyl methacrylate)hydrochloride(HAMA)，并将其作为不含DA基团的对照组(Ctrl)。

B.核磁共振(NMR)光谱中6.5-7.2ppm的峰表示DA基团的邻苯二酚环上的质子。5.68和6.13ppm归属于化合物的C⋅C键质子AEMA组。此外，与HA聚合物Fourier transform infrared(FTIR)光谱相比，合成的HAD和HAMA聚合物都显示了1633cm⁻¹的波数，属于AEMA基团的C⋅C键。此外，与HAMA样品相比，HAD样品在邻苯二酚基团接枝形成的约3360cm⁻¹处的OH基团峰强度增加。

C.因此，1h NMR和FTIR分析结果都证实了在HAD聚合物中AEMA和DA基团成功接到HA聚合物链上。HAD前驱体在不同剪切速率下的流变试验证实，其剪切能力与HAMA(HA聚合物接枝与AEMA基团)和HA聚合物溶液相似。

D.HAD前驱体的粘度低于HA溶液，但高于HAMA溶液。DA组的羟基部分保持了氢相互作用，导致与HA相同的粘度水平。总的来说，由于HAD前驱体的剪切变薄特性，它是可注射的。在紫外(UV)照射(365nm)15s的情况下，在苯基(三甲基苯甲酰)膦酸锂(LAP)光引发剂的存在下，将HAD水前驱体水溶液光交联形成HAD水凝胶。在扫描电子显微镜(SEM)下证实了冻干HAD水凝胶的多孔微结构。在流变学研究中考察了水凝胶的力学性能。频率扫描测试表明，在0.1-10Hz的频率范围内，所有样品的存储模量(G0)均高于损耗模量(G00)，这表明它们在光交联后具有良好的凝胶网络。

E.特别是，由于HAD中儿茶酚基团的亲水性，HAD水凝胶的G0略低于HAMA水凝胶。此外，在浸泡4500min(3天)后，HAD水凝胶的平衡膨胀率约为380%，而HAMA水凝胶的平衡膨胀率仅为100%左右。这些结果还表明，HAD水凝胶中儿茶酚基团的亲水性有助于其膨胀行为。

F.将HAD前体液移至猪心脏表面，评价HAD在心脏组织中的粘附性能。光交联HAD水凝胶粘附在心脏表面，流水不能将其冲洗掉。在与胸腔内其他器官的摩擦中，HAD水凝胶具有良好的粘附性，可保持其完整性。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中肿胀24小时的HAD水凝胶在心脏表面也保持了良好的粘附。

G.因此，即使在胸腔液体中肿胀后，HAD仍会粘附在心脏组织上。HAD的良好粘附性可以通过HAD的儿茶酚基团与心脏组织表面蛋白质中的天然亲核试剂(氨基键、硫醇和胺)之间的强相互作用来解释。

H.针刺、拉伸、扭曲和弯曲HAD水凝胶在心脏组织裂缝部位保持稳定性和完整性。此外，HAD水凝胶可以阻止心脏出血。心脏深处的伤口导致血液渗漏，周围液体环境呈淡红色半透明。

I.然而，HAD水凝胶密封阻止了心脏伤口的血液泄漏，并将周围液体恢复到自然的透明、无色、透明状态。另一方面，通过测定水凝胶的干重，对HAD水凝胶的体外降解性能进行了研究。结果显示，在pH7.4的PBS中孵育4周后，约22%重量的HAD水凝胶和24%重量的HAMA水凝胶降解。此外，还评估了HAD水凝胶的体外生物相容性。在第1天和第3天，HAD组和Ctrl组都很少观察到死亡细胞(红色荧光)。统计结果显示HAD组与Ctrl组的细胞活力无显著差异，说明HAD水凝胶具有良好的生物相容性。

图3

要点3：

A.HAD水凝胶表现出不对称粘附，这种不对称粘附由光交联控制。图2F显示，由于其儿茶酚基团与心脏组织表面蛋白质中的天然亲核试剂之间的强相互作用，HAD前体粘附在猪心脏组织上。HAD水凝胶的外表面表现出抗粘附行为，因为交联的AEMA网络限制了儿茶酚基团的运动，并阻止它们与心脏表面亲核试剂相互作用(溶胶-粘附过程)。

B.相反，当HAD前体在应用于心脏组织表面之前进行交联时，HAD水凝胶无法粘附，因为儿茶酚基团的运动受到限制(凝胶-非粘附过程)。

C.采用搭剪试验评价HAD水凝胶的不对称黏附性，并测定其在溶胶-黏附和凝胶-非黏附过程中与心脏组织的黏附强度。心脏组织切割成15mm×30mm×6mm的薄片，用于随后的试验。在溶胶-黏附过程中，HAD水凝胶的黏附强度(11.62±1.19kPa)显著高于HAMA水凝胶(2.89±0.22kPa)(P<0.01)。

D.HAD水凝胶含有大量的游离儿茶酚基团，它们与心脏表面蛋白质中的天然亲核试剂有强烈的相互作用。相比之下，HAMA水凝胶缺乏能够粘附在心脏组织上的足够成分。HAD水凝胶还具有比纤维蛋白胶更大的粘附强度。在凝胶-非粘接工艺下，HAD和HAMA水凝胶的粘接强度都很低(<0.33kPa)。剪切实验结果表明，由于光交联和儿茶酚基(DA)，HAD水凝胶具有不对称粘附性。成纤维细胞和巨噬细胞被免疫系统募集来促进术后粘连。使用L929成纤维细胞和RAW264.7巨噬细胞来评估HAD的体外抗黏附能力，这两种细胞通常与术后黏附有关。将细胞接种到HAD水凝胶表面。

E.安装在玻璃载玻片上的细胞作为Ctrl键。活/死染色显示HAD水凝胶表面很少有圆形细胞，但大量广泛分布的细胞粘附在玻片上。细胞增殖实验证实，粘附在HAD水凝胶表面的少量L929成纤维细胞和RAW264.7巨噬细胞在培养3天内没有增殖。相反，同样的细胞在载玻片上正常增殖。阴离子HA在大多数哺乳动物细胞中抑制附着和扩散，因为其带负电荷的表面排斥带负电荷的细胞膜。DA组提供细胞粘附位点。然而，在光交联HAD水凝胶中，它们被固定在网络内，不能促进细胞粘附。由于HAD水凝胶可以抵抗细胞粘附，它也可能潜在地抑制心脏手术后的粘附。

图4

要点4：

A.根据先前报道的方案将人诱导多能干细胞(hiPSC)细胞分化为hiPSC-CMS。分化后，流式细胞术结果显示92.59%的iPSC-CMS心肌肌钙蛋白T(cTnT)阳性，提示iPSC分化效率高。免疫荧光图像也显示α-肌动蛋白和cTnT阳性表达。外泌体从hiPS-CM培养基中提取，命名为iCM-EXOs，并通过透射电子显微镜(TEM)，纳米颗粒跟踪分析(NTA)和Zetasizer纳米分析对其进行了表征。在TEM下，iCM-EXOs表现出典型的“cup rim”形态。B.NTA显示，iCM-EXO直径的平均值和范围分别为91nm和70-125nm。

C.iCM-EXO具有负的zeta电位(-16.7mV)，因此是稳定的。

D.Western blotting证实在iCM-EXO中存在外泌体特异性标记CD9、CD63、Syntenin和Alix。荧光成像证实了CMs吸收iCM-EXO的能力。用pkh26标记的iCM-EXO培养原代心肌细胞时，前者获得红色荧光，这意味着它们吸收了标记的iCM-EXO。上述结果验证了来自hiPS-CMs的iCM-EXO的成功制备和吸收。

E-F.分别用PBS、H2O2和H2O2处理原代心肌细胞，并使用膜联蛋白V-fluorescein isothiocyanate(FITC)和碘化丙啶(PI)染色来评估细胞凋亡。流式细胞术证实H₂O₂处理后(H₂O₂组)所有细胞的凋亡率>46.9%，而无H₂O₂处理时(对照组)所有细胞的凋亡率仅为11.8%。在iCM-EXOs+H₂O₂组(H₂O₂+iCMEXOs组)存在时，只有33.9%的细胞凋亡。细胞凋亡率明显低于H₂O₂单独处理的细胞(P<0.01)。

G.CCK-8检测显示，H₂O₂+iCM-EXOs组的细胞活力高于H₂O₂组。因此，iCMEXOs可以保护细胞免受H₂O₂处理后发生的凋亡。

H-I.然后，研究了iCM-EXOs对原代心肌细胞氧化应激的影响。dichlorofluorescein(DCF)染色显示ROS的产生。DCF染色图像、定量统计分析和流式细胞术显示，iCM-EXO处理显著降低h2o2刺激的CMs中ROS的生成。JC-1染色检测H₂O₂处理后原代心肌细胞线粒体的变化。JC-1是一种荧光亲脂性碳氰染料，用于可视化线粒体膜电位(Δψm或MMP)。绿色和红色荧光分别表示低和高的MMP。图4J显示，在Ctrl和H₂O₂+iCM-EXOs组中，相对较多的细胞发出红色荧光，而在H₂O₂组中，相对较多的细胞发出绿色荧光。

K.H₂O₂+iCM-EXOs组的红绿荧光比明显高于H₂O₂组。

L-M.此外，MMP的流式细胞术也显示出相同的趋势。因此，iCM-EXO可能会阻碍氧化应激诱导的MMP扰动为了阐明iCM-EXOs对H₂O₂诱导的氧化损伤的分子机制，通过Western blotting检测了nuclear factor erythroid 2–related factor 2(Nrf2)、ECH-associated protein-1(Keap1)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化还原酶1(NQO1)和血红素加氧酶1(HO-1)的表达。与对照组相比，H2O2组胞质Nrf2水平较低，NQO1和HO-1水平较高。相反，iCM-EXO处理显著抑制了H₂O₂处理心肌细胞胞质Nrf2蛋白的降低和NQO1和HO-1的升高。各组Keap1的表达差异无统计学意义(P>0.05)，说明Keap1发生的是构象变化，而非与Nrf2表达相关的表达变化。上述结果表明，iCM-EXOs在体外抑制Nrf2激活，减轻原代心肌细胞氧化应激，在体内具有潜在的抗氧化作用。

图5

要点5：

A.将iCM-EXOs重悬在HAD前体溶液中，将其装载到HAD水凝胶中。光交联后，将iCM-EXOs封装在HAD水凝胶中，该产物被命名为HAD+EXOs水凝胶。用PKH26预标记iCMEXO，将HAD水凝胶与FITC混合，以观察HAD水凝胶中的iCM-EXOs。荧光图像显示pkh26标记的iCMEXO在水凝胶内均匀分布。

B.荧光图像的三维(3D)视图证实了iCM-EXOs在HAD+EXO水凝胶中的均匀分布。

C.HAD+EXOs水凝胶截面的荧光强度分析显示出良好的纵向和横向iCM-EXO分布。此外，在iCM-EXOs包封后，HAD+EXO水凝胶与HAD水凝胶在储存模量方面没有显著差异(P>0.05)。将HAD+EXO在37°C的PBS中浸泡15天，模拟iCMEXO在体内的持续释放。后者采用微双胞霉素酸(BCA)蛋白检测试剂盒，按照制造商的说明进行检测。iCM-EXOs的标准曲线。iCM-EXOs从HAMA+EXO水凝胶中迅速释放。到第7天，83.2%的iCM-EXOs被释放。相比之下，在第7天，只有58.0%的iCM-EXOs从HAD+EXO水凝胶中释放出来。HAMA+EXOs水凝胶的iCMEXOs缓释在第11天达到95.2%的上限。

D.然而，到第13天，只有89.9%的iCM-EXOs从HAD+EXO水凝胶中释放出来。上述结果表明HAD+EXOs水凝胶具有令人满意的缓释行为和HAD水凝胶递送外泌体的潜在能力。

图6

要点6：

A.显示切除部分心包以释放心包积液，暴露心外膜。然后用针头刺了后者100次，以诱导出血。该方法模拟了心包不完整、心包积液漏、自体出血并发急性炎症和氧化应激以及慢性心包粘连的心脏手术后状况。HAD或HAD+EXOs前体溶液应用于心外膜出血部位。光交联HAD和HAD+EXOs水凝胶完全覆盖靶位点。然后，用吲哚菁绿(ICG)标记水凝胶前体，在近红外(NIR)光下观察它，并测量HAD+EXO和HAD水凝胶在心脏表面的保留时间。心脏手术后的第一周是氧化应激和免疫反应发生的急性期。

B.当时，HAD和HAD+EXOs水凝胶诱导在开胸(缝合)部位的心脏有强烈的信号。

C.心脏手术后两周，HAD水凝胶和HAD+EXOs水凝胶信号下降到近红外水平以下。

D-E.HAD和HAD+EXOs水凝胶的滞留时间无显著差异。因此，iCM-EXO包封对HAD+EXO水凝胶在体内的滞留时间没有影响。还测量了心脏手术后7天的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平。由于HAD+EXOs水凝胶提供持续的iCM-EXO释放，HAD+EXOs组在体内氧化应激反应中分泌的SOD和GSH比HAD组和模型组相对较多。

F-G.然后，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)和定量聚合酶链反应(qPCR)来测量促炎细胞因子白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-6的基因和蛋白表达水平。与模型组相比，HAD+EXOs水凝胶显著(P<0.05)和HAD+EXOs水凝胶非常显著(P<0.001)下调了所有三种细胞因子。

H.这些结果表明，心脏手术后，HAD+EXOs水凝胶提供的持续iCM-EXO释放具有抗氧化和抗炎作用。

图7

要点7：

A.在心脏手术后2周比较HAD+EXOs水凝胶、iCM-EXOs、HAD水凝胶和模型组的心包粘连。胸腔重新打开后进行了心包粘连形成的大体检查。术后摘取心脏的代表性图像如图7A所示。

B.将每个心脏分为9个切片，每个切片的粘连严重程度按0到4分进行评分。模型组和iCM-EXO组在上述三个得分方面没有显著差异。因此，体外给药抑制氧化应激不能防止体内心包粘连。

C.相比之下，与模型组相比，HAD组和HAD+EXOs组术后粘连明显减少。HAD组和HAD+EXOs组的平均粘附强度评分(0.94±0.68)均低于模型组(1.83±0.72)。

D.HAD组(0.54±0.52)和HAD+EXOs组(0.15±0.22)的平均粘附分数均低于模型组(1.44±1.04)。苏木精和伊红(H&E)染色显示模型组和iCM-EXO组心脏表面纤维组织丰富，粘连严重。相比之下，在HAD和HAD+EXOs组中，心脏表面仅检测到稀疏的纤维组织。

E.HAD组和HAD+EXOs组术后心脏表面纤维组织分别约为4.73±1.2%和3.03±0.43%。另一方面，模型组和iCM-EXOs组术后心脏表面纤维组织分别为22.23±4.04%和20.93±1.04%。

F-G.在本研究中，在HAD+EXOs组的粘附侧仅观察到少量GATA6+巨噬细胞(红色)，而在术后1周，模型组的粘附侧招募了大量GATA6+巨噬细胞。巨噬细胞清道夫受体1(MSR-1);模型组黏附部位外周区有丰富的正电荷。因此，GATA6+巨噬细胞被招募到这些部位，并有助于术后粘连。相比之下，在HAD+EXOs组的粘附位点检测到很少的MSR-1。上述结果表明，HAD+EXOs水凝胶可能通过抑制GATA6+腔巨噬细胞向粘连部位的募集来预防大鼠心脏手术模型术后粘连。

图8

要点8：

A.在心脏手术后4周评估术后粘连，以评估相对于未治疗模型，HAD、iCMEXOs和HAD+EXOs治疗的长期疗效。术后粘连形成减少的总体评估如图8A所示。HAD和HAD+EXOs组黏附不明显，而模型组和iCM-EXOs组黏附明显。H&E染色显示各组术后心脏表面粘连程度不同。模型组和iCM-EXOs组在心脏表面表现出丰富的纤维组织和严重的粘连，而HAD组和HAD+EXOs组的心脏表面仅观察到稀疏的纤维组织。各治疗组术后4周平均粘连、粘连强度评分及最大粘连强度均低于术后2周。然而，粘连评分在治疗组间仍有显著差异。

B.与模型组和iCM-EXOs组相比，HAD+EXO组和HAD组的平均粘附强度(分别为0.07±0.19和0.36±0.38)较低(1.07±0.80and0.86±0.85)。平均粘附分数和最大粘附强度的变化趋势相似。

C.上述结果表明，心脏手术后，HAD和HAD+EXOs治疗均保持长效抗粘连效果。术后4周，通过超声心动图评估心脏的收缩和舒张功能。在研究中，针刺法可以诱导出血和术后粘连，而不影响心功能，因此假手术组与模型组无统计学差异。

D.此外，治疗组和模型组在射血分数、分数缩短、收缩末期左室内径方面无显著差异(LVIDs)，或舒张末期左室内径(LVIDd)。因此，在HAD+EXOs水凝胶应用后，心功能保持正常。此外，超声心动图显示HAD+EXO对心功能没有显著影响。

本文小结：

综上所述，研究结果介绍了一种可注射的Janus水凝胶，它在光交联后表现出不对称的粘附特性，持续输送诱导多能干细胞衍生的心肌细胞外泌体(iCM-EXO)，用于减少心脏手术后的粘附。研究结果在大鼠心脏术后模型中，负载iCM-EXO的Janus水凝胶表现出双重功能，可作为抗氧化剂和抗心包粘附剂。这些水凝胶通过抑制巨噬细胞从胸腔的募集，有效地保护iCM-EXO免受GATA6⁺腔巨噬细胞清除。这些结果突出了负载iCM-EXO的Janus水凝胶在涉及心脏手术患者的试验中进行临床安全性和有效性验证的巨大潜力，最终有望用于在心脏直视手术期间进行常规给药。

参考文献：

Wang, L., Chen, P., Pan, Y., Wang, Z., Xu, J., Wu, X., Yang, Q., Long, M., Liu, S., Huang, W., Ou, C., & Wu, Y. (2023). Injectable photocurable Janus hydrogel delivering hiPSC cardiomyocyte-derived exosome for post-heart surgery adhesion reduction. Science advances, 9(31), eadh1753.

https://doi.org/10.1126/sciadv.adh1753