IF16.0 Molecular Cell│由FTO位点的lncRNA作为m6A writer复合体和p53肿瘤抑制信号的抑制剂

前言：

2023年7月20日，美国梅奥医学中心黄浩杰教授、芝加哥大学何川教授以及上海交大学医学院附属第一人民医院泌尿外科临床医学中心张嘉农研究员团队在Molecular Cell上在线发表题为“A lncRNA from the FTO locus acts as a suppressor of the m6A writer complex and p53 tumor suppression signaling”的研究论文。该研究发现，前列腺癌进展过程中一个位于FTO基因内含子区域的非编码RNA(FTO-IT1)表达显著升高，升高的FTO-IT1通过抑制METTL3/METTL14/WTAP/RBM15甲基转移酶复合体降低信使RNA（mRNA）上的m⁶A修饰，并抑制p53靶基因mRNA的稳定性和表达。该发现不仅阐明了继TP53基因突变（或缺失等基因组变化）和p53蛋白异常降解（如MDM2高表达）机制之后p53信号通路失活的又一途径，还揭示了非编码RNA在前列腺癌进展过程中的关键作用并提供了FTO-IT1 作为癌症的潜在治疗靶点。

背景介绍：

N⁶-甲基腺苷(m⁶A)是脊椎动物细胞中最常见的RNA转录后修饰。这种修饰是由主要包含METTL3、METTL14、WTAP和RBM15组成的“writer”复合物催化的，其中METTL3是负责铸造m⁶A的甲基转移酶(MTase)，而RBM15和它的同源物RBM15B能够偶练大量的mRNA连接到writer复合物上进行甲基化。尽管RNA m⁶A修饰是可逆的，并且可以通过去甲基化酶FTO和AlkB同源物5(ALKBH5)，关于MTase writer复合物本身的有效活性是如何调节的，尤其是非编码RNA(ncRNA)的调节，在很大程度上仍未得到探索。FTO基因位点已被确定为许多与癌症和肥胖相关的生物学功能的重要基因组/表观基因组中心。FTO作为RNA m⁶A去甲基化酶、氨基酸的细胞传感器和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白1(mTORC1)的激活剂与癌症和肥胖有关。与基因组变异(如FTO基因1和2内含子中的单核苷酸多态性(SNP))与人类肥胖风险密切相关的报道一致，在SNP区域内发现了一些活性增强子，并与肥胖促进基因的反激活有关。P53是保护基因组完整性和抑制肿瘤发生的最重要的肿瘤抑制因子之一。P53发挥肿瘤抑制功能的主要途径是作为转录因子，通过转录激活下游参与细胞周期阻滞、衰老和凋亡的靶基因，如CDKN1A(p21WAF1)、PUMA、FAS和TP53INP1。P53还可以通过转录激活SESTRIN(SESN)家族基因，如SESN2来抑制细胞生长，SESN2是已知的mTORC1复合物的负调控因子。研究结果进一步支持了p53在肿瘤抑制中的重要性，TP53基因在大约50%的人类癌症(包括晚期前列腺癌)中由于基因突变和/或缺失等基因组改变而失活。P53的抑癌功能也受蛋白翻译后修饰(包括乙酰化和甲基化)的调控。然而，除了TP53基因/蛋白本身，影响p53肿瘤抑制信号网络的主要途径尚不明确。

图文解析：

图1

要点1：

A-B.在已知的11个m⁶A“writer”和“eraser”基因中，发现ncRNA在其中3个基因位点或附近表达，而FTO基因内含子8转录的长链ncRNA(lncRNA)FTO-IT1在C4-2R细胞中与C4-2C细胞相比显著上调。

C-D.RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)分析显示，FTO-IT1同时存在于C4-2细胞的细胞质和细胞核中，ENZ处理诱导FTO-IT1表达，但对FTO-IT1细胞分布无明显影响。

E.已知DTX可抑制AR功能，与对照细胞相比，抗DTX的22Rv1、C4-2和LNCaP细胞中FTO-IT1而非FTO的表达水平更高。因此，FTO-IT1lncRNA是AR的抑制靶点，ENZ和DTX在PCa细胞中促进FTO-IT1的去抑制和OE。

F.来自TCGA队列的原发性PCa样本转录组学数据分析显示，FTO-IT1在晚期(T3b和T4)肿瘤中的表达高于早期(T2a至T3a)。G.与原发肿瘤相比，FTO-IT1 RNA在转移性CRPC组织中显著上调。

H-I.通过对PCa中经常发生的改变(如AR扩增、TMPRSS2-ERG融合和TP53基因缺失/突变)的肿瘤进行分层，研究发现高水平的FTO-IT1与TCGA中较差的PFS和WCDT中仅有WT-TP53的肿瘤患者较差的总生存率显著相关。

图2

要点2：

A.点印迹和质谱分析显示，FTO-IT1 KO显著增加了C4-2R和22Rv1细胞系中mRNA m⁶A的水平。

B.通过进行大量RNA-seq和m⁶A甲基化mRNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)，在模拟和FTO-IT1 KO细胞的两个重复中分别鉴定出10,038和14,739个m⁶A峰重叠。在MOCK KO 22Rv1细胞中，m⁶A峰形成重叠的两个复制，在FTO-IT1 KO 22Rv1细胞中，两个复制重叠产生m⁶A峰。在模拟和FTO-IT1 KO 22Rv1细胞中发现的m⁶A峰与两个复制重叠。

C.同样，与对照细胞相比，FTO-IT1 KO 22Rv1细胞中大量单个m⁶A峰(n=3201)被上调，但较少数量的峰(n=573)被下调。与对照细胞相比，FTO-IT1 KO细胞主要在编码序列(CDS)和3'UTR部分显示m⁶A增加。与先前的报道一致，m⁶A频率在停止密码子附近达到峰值，但与对照细胞相比，FTO-IT1 KO细胞的峰值更高。这些发现揭示了FTO-IT1在抑制细胞整体mRNA m⁶A水平中的作用。

D.Bulk RNA-seq显示，与对照22Rv1细胞相比，FTO-IT1 KO中有1229个上调基因和1777个下调基因。通路分析表明，上调基因在p53转录基因网络等少数通路中富集，而下调基因在PLK1和AURORA B信号通路中富集。

E.聚类分析显示649个上调基因(超向上)中有1226个高甲基化峰，而188个下调基因(超向下)中只有253个高甲基化峰。这一结果表明m⁶A高甲基化在22Rv1细胞中与更多上调基因相关，揭示了FTO-IT1对高上调基因的调控。

F.与高甲基化靶基因类似，p53转录靶基因也是FTO-IT1缺失诱导的高表达基因之一。

G-I.基因集富集分析(GSEA)进一步证实p53通路的富集是FTO-IT1 KO细胞的标志性变化。事实上，一组(n=36)p53通路基因，包括GSEA定义的FAS、TP53INP1、SESN2和MDM2，在FTO-IT1 KO细胞中相对于对照细胞显著上调。

J.MeRIP-qPCR进一步证实了这些结果。

K-L.FTO-IT1敲除增加了这些mRNA的稳定性及其在mRNA和蛋白水平上的表达。FTO-IT1 KO适度降低了22Rv1和C4-2R细胞中p53蛋白的稳态水平和半衰期，这与MDM2适度增加是一致的，MDM2是一种已知的靶向p53蛋白降解的E3泛素连接酶。

图3

要点3：

A-B.菌落形成试验显示，FTO-IT KO 22Rv1和C4-2R细胞的生长速度远慢于对照细胞。

C-D.FTO-IT1敲除诱导22Rv1细胞G1细胞周期阻滞。SESTRIN(SESN)家族蛋白在mTORC1和mTORC2的抑制中发挥重要作用，激活mTORC1和mTORC2可诱导细胞周期驱动因子上调和细胞周期抑制因子下调与已知p53靶基因SESN2的上调以及mTORC1下游效应因子S6K磷酸化的下调一致。

E-G.SESN2的缺失消除了FTO-IT1 KO诱导的细胞周期阻滞，表明SESN2在介导FTO-IT1细胞周期调控中发挥了重要作用。

H-O.FAS和TP53INP1是已知的两个促进细胞凋亡的p53靶基因。FTO-IT1敲除诱导了细胞凋亡，而敲除FAS或TP53INP1分别部分减弱了22Rv1细胞中FTO-IT1 KO诱导的凋亡。

图4

要点4：

A-D.由于FTO-IT1的操作并没有显著影响m⁶A writer和erasers的表达水平，研究人员试图确定FTO-IT1是否与这些蛋白结合。RNA pull-down和质谱分析显示，FTO-IT1与280个蛋白唯一结合，其中RBM15是唯一的m⁶A修饰蛋白。

E.Western blot分析证实，FTO-IT1与RBM15相互作用强，与RBM15B、METTL3、METTL14和WTAP相互作用弱，但与writer复合体的其他成员无明显关联。

F-I.体外蛋白拉下实验显示，FTO-IT1直接与RBM15结合，而不是与METTL3、METTL14和WTAP结合。

J-L.CLIP-qPCR检测显示，RBM15与FTO-IT1的3'-茎环区(SL3)结合。反过来，使用全长和SL3截断的FTO-IT1 RNA进行RNA下拉，证实SL3是RBM15结合所必需的。

M-N.与GST和GST-RBM15重组蛋白和玻璃体转录的FTO-IT1进行RIP分析，结果显示FTO-IT1直接结合到RBM15的RRM1结构域。

图5

要点5：

A.CLIP-seq鉴定的3498个RBM15结合mRNA与已建立的p53通路基因显著重叠,在68个重叠的p53靶点中，49个mRNA发生m⁶A甲基化，其中13个mRNA在FTO-IT1 KO时发生高甲基化，包括FAS、TP53INP1、SESN2和MDM2。

B.CLIP-seq和m6A IP数据显示，FAS、TP53INP1、SESN2和MDM2基因体内的RBM15结合位点和m⁶A峰值位点具有显著的一致性。

C-D.CLIP-qPCR证实，FTO-IT1 KO和OE分别增加和减少了这些p53靶基因mRNA的RBM15结合，但对其他p53靶基因(如JUN、LDHB和NOTCH1)有混合作用，而对FTO-IT1不影响的RBM15结合靶基因MYC和RBM15未结合靶基因HPRT1无影响。

E-J.RBM15敲低不仅降低了这些p53靶基因mRNA的基础m⁶A水平及其表达，而且还消除了FTO-IT1 KO诱导的m⁶A甲基化和这些mRNA表达的增加。考虑到RBM15是调控RNA m⁶A甲基化的m⁶A复合体的关键成分，研究人员试图确定m⁶A MTase复合体在FTO-IT1调控p53靶基因mRNA上m⁶A水平中的作用。通过敲除MTase复合物的催化亚基METTL3获得了类似的结果。这些数据说明FTO-IT1对p53靶基因mRNA m⁶A的修饰和表达的影响主要是通过MTase writer complex介导的。

图6

要点6：

A.先前的研究表明m⁶A通过共转录沉积在mRNA上为了研究RBM15如何调节p53靶基因mRNA m⁶A水平，对BioGRID数据库中质谱鉴定的p53相互作用蛋白进行了分析，发现RBM15是p53结合的唯一m⁶A修饰因子。

B-C.在内源性水平上，p53与RBM15有强烈的相互作用，与METTL3有轻微的相互作用，但与m⁶A复合物的其他核心成分，包括METTL14、WTAP和RBM15B没有相互作用。反向CoIP证实了这一结果。此外，敲除FTO-IT1不影响RBM15和p53蛋白的细胞定位以及RBM15与p53和其他MTase复合物组分的相互作用。使用GST-RBM15重组蛋白和体外转录和翻译的p53蛋白进行GST下拉实验显示，

D-E.RBM15 C端的SPOC结构域直接与p53蛋白结合。

F-G.反过来，发现p53 DNA结合域(DBD)是RBM15相互作用所必需的。

H-I.RBM15 ChIP-qPCR分析显示，RBM15与这些p53靶基因位点结合，但TP53 KO在很大程度上削弱了这种结合。CoIP实验表明，SPOC结构域的缺失消除了p53与RBM15的结合。

J-L.进一步发现，WT RBM15而不是RBM15ΔSPOC突变体的表达恢复，增加了m6A水平和p53靶mRNA的表达，突出了RBM15在调节p53靶基因mRNA m⁶A水平方面的重要性。RBM15ΔSPOC在调节p53靶mRNA m⁶A和表达方面的缺陷也可以解释为该突变体无法与MTase复合物相互作用，这些数据表明RBM15直接结合p53蛋白，调控p53靶基因mRNA m⁶A的修饰和表达。

图7

要点7：

A-C.证明了FTO-IT1 KO在体内很大程度上抑制了C4-2R肿瘤的生长。免疫组化(IHC)结果显示，FTO-IT1 KO降低了这些肿瘤的增殖，增加了细胞凋亡。

D.研究人员设计了FTO-IT1特异性反义寡核苷酸(ASOs)，并确定了两个最有效的反义寡核苷酸(#3和#6)，它们产生了>80%的FTO-IT1表达减少。

E-G.这两种FTO-IT1 ASOs在22Rv1和C4-2R细胞中显著增加了p53靶基因的表达。ASO处理大大增加了裂解的PARP1水平，降低了RB磷酸化，并显著抑制了细胞增殖和集落形成能力。FTO-IT1 ASOs也增加了C4-2R和22Rv1细胞的mRNA m⁶A水平。

H-M.FTO-IT1 ASO给药可显著抑制肿瘤生长，但对小鼠体重无抑制作用。ASO处理还增加了肿瘤中m⁶A的总体丰度，增加了p53靶基因mRNA m⁶A的水平和表达，抑制了细胞增殖，诱导了细胞凋亡。这些数据表明，过表达的FTO-IT1是一种可行的癌症治疗靶点。

图8

要点8：

FTO通过作为RNA m⁶A去甲基化酶影响了广泛的生物过程。FTO还控制mTORC1活性和独立于去甲基酶功能的氨基酸感应此外，FTO基因内含子1中的增强子活性与肥胖相关的SNP(基因组变异)以及IRX3表达在肥胖中的作用有关。在这项研究中，观察到FTO-IT1，一个由FTO基因的最后一个内含子转录的lncRNA，在PCa的进展过程中过度表达。此外，过表达的FTO-IT1通过结合和干预m⁶A MTase复合物的活性，诱导PCa细胞中global和p53靶基因mRNA m6A水平下调。因此，研究确定了一个以前未被表征的ncRNA作为FTO基因位点的另一个关键功能元件，该元件抑制mRNA m⁶A修饰和p53靶基因(如SESN2)的表达，SESN2是mTORC1和p53肿瘤抑制功能的关键负调节因子。

本文小结：

综上所述，研究表明，FTO-IT1 OE诱导的p53靶基因mRNA m⁶A修饰的抑制、p53靶基因网络的失活以及肿瘤生长的增强可以通过FTO-IT1的治疗靶向来消除。研究发现，ASO消除FTO-IT1不仅可以恢复p53靶基因的表达，而且在体外和小鼠体内很大程度上抑制PCa细胞的生长。研究结果强调，过表达的FTO-IT1可能是肿瘤的可行生物标志物和治疗靶点，特别是对于那些mRNA m⁶A甲基化依赖性p53肿瘤抑制网络被过表达的FTO-IT1失活的p53-WT病例。虽然发现FTO-IT1直接与RBM15结合并抑制其对mRNA m⁶A修饰的作用，但并非所有与RBM15结合的m⁶A修饰的p53靶基因mRNA都受到FTO-IT1的影响，潜在机制仍有待研究确定。

参考文献：

Zhang J, Wei J, Sun R, et al. A lncRNA from the FTO locus acts as a suppressor of the m6A writer complex and p53 tumor suppression signaling[J]. Molecular Cell, 2023.

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.06.024