IF7.0 Cell Death Discovery│苦参碱衍生物6j通过ATF3介导的铁死亡抑制肝癌细胞增殖

前言：

2023年8月14日，广西大学医学院田鲲鹏团队在Cell Death Discovery发表题为“Sophoridine derivative 6j inhibits liver cancer cell proliferation via ATF3 mediated ferroptosis”的研究论文，该研究探讨了苦参碱碱衍生物6j在体外和体内具有良好的抗肝癌作用。化合物6j可通过促进细胞内Fe²⁺、活性氧簇(ROS)和MDA的蓄积诱导肝癌细胞铁死亡。ferrostatin-1抑制铁死亡减轻了6j诱导的Fe²⁺、ROS和MDA积累，恢复了细胞活力。进一步的研究表明，化合物6j通过内质网应激上调ATF3的表达，通过RNA干扰敲低ATF3可减弱6j诱导的铁死亡和细胞增殖抑制。本研究将为铁死亡诱导剂的设计和抗肝癌药物的开发提供新的思路。

背景介绍：

肝癌是癌症相关死亡的第四大原因，每年死亡83万多例。肝细胞癌(HCC)、肝内胆管细胞癌( ICC)和HCC-ICC混合型是肝癌的主要类型。目前，肝癌的治疗主要包括手术治疗、放化疗、靶向治疗和免疫治疗。外科治疗是早期肝癌患者的最佳治疗策略。然而，大多数患者确诊时已属晚期，失去了手术的最佳时机。全身放疗毒副作用较大，而传统化疗药物(5-氟尿嘧啶、顺铂、多柔比星和吉西他滨)临床疗效差。虽然靶向治疗药物取得了一定的临床疗效，但目前只有索拉非尼和仑伐替尼作为一线靶向药物上市治疗晚期肝癌患者，且患者易出现耐药。免疫治疗已成为一种有希望的治疗方法。然而，肝癌患者对免疫治疗的总体反应率低于30%。尽管肝癌的治疗取得了很大的进展，但耐药、可供患者选择的药物少、不良反应大等问题仍然是主要障碍。因此，开发治疗肝癌的新药具有重要意义。铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化引起的非凋亡性坏死性细胞死亡。内质网(ER)作为细胞中膜脂质最丰富的细胞器之一，对铁死亡的启动至关重要。营养缺乏、缺氧、细胞钙稳态失衡、化疗等因素均可诱发内质网应激。大量研究表明，在各种疾病中，内质网应激可以促进铁死亡。ATF3是ATF/CREB家族的转录因子，在多种肿瘤中发挥抑癌作用，抑制肿瘤发生、上皮-间充质转化、肿瘤细胞侵袭和迁移。作为内质网应激通路的下游靶点，ATF3被内质网应激触发的PERK/ATF4轴上调。ATF3的激活对许多化疗药物诱导的铁死亡至关重要，如索拉非尼、erastin、马钱子碱和顺铂。近年来，铁死亡被报道在肿瘤治疗中发挥重要作用。研究发现，铁死亡可以降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的获得性耐药性。在肿瘤细胞中诱导铁死亡可以增强免疫治疗的效果。此外，铁死亡还介导了放疗和免疫治疗在肿瘤治疗中的协同作用。这些结果表明，铁死亡是一个潜在的靶点，药物ATF3可能是肿瘤治疗的一种选择。苦参碱是一种从苦参中提取的天然植物生物碱，也是中药复方苦参注射液的主要活性化合物，于2005年被批准用于治疗恶性滋养细胞肿瘤。研究表明苦参碱碱通过抑制DNA Top I发挥抗癌作用。苦参碱碱作为一种理想的先导化合物，具有支架特殊、结构简单、溶解度高等多种类药物特性。在研究人员之前的研究中，研究人员合成了一系列槐甾醇的衍生物，衍生物6j在不影响Top I活性的情况下，对肝癌、肺癌和鼻咽癌表现出最强的细胞毒性作用，这表明6j可能有一种替代的抗癌机制。本研究旨在探讨6j的抗肝癌作用及其机制。

图文解析：

图1

要点1：

A-D.6j对这6种肝癌细胞株具有较强的抑制增殖作用，IC50低于10μM。HepG2和MHCC-97H细胞株较其他4种肝癌细胞株更敏感。因此，选择这两个细胞系进行下一步的研究。然后，研究人员在这两个细胞系上执行细胞集落形成测定，这表明化合物6j以剂量依赖性方式显著抑制集落形成。将6j分别与凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK)、自噬抑制剂(3-MA)和坏死抑制剂(Nec-1)共培养，检测细胞活力，揭示6j诱导增殖抑制的作用模型。结果显示，Z-VAD-FMK、3-MA和Nec-1对6j诱导的细胞毒性无影响，表明6j通过不同于凋亡、自噬和坏死的另一种机制表现出其抗增殖作用。

图2

要点2：

A.研究人员想知道6j是否通过诱导铁死亡来发挥其抗增殖作用。为了验证这一假设，研究人员首先检测了细胞内Fe²⁺的含量。结果表明，6j可以以剂量依赖的方式增加细胞内Fe²⁺的含量。

B.然后，对脂质过氧化进行评估，结果显示，脂质过氧化指标MDA在6j处理的细胞中升高。

C.此外，在6j处理的细胞中观察到明显的ROS积累。这些结果证实了6j可以诱导肝癌细胞发生铁死亡。

图3

要点3：

A-D.为了进一步验证铁死亡在6j诱导的细胞增殖抑制中的作用，研究人员将铁死亡抑制剂Fer^-1和6j共处理细胞。检测细胞内Fe²⁺含量、MDA、ROS和细胞活力。结果表明，fer^-1可以减轻6j诱导的Fe²⁺积累，MDA, ROS和细胞增殖抑制。这些结果表明6j通过诱导铁死亡抑制肝癌细胞增殖。

图4

要点4：

A-C.为了阐明6j诱导铁死亡的机制，研究人员对6j处理和未处理的细胞进行了RNA-seq分析。在6j处理的细胞和未处理的细胞之间，共鉴定出588个差异表达基因(DEGs)。对这588个DEGs的富集分析显示，铁死亡信号通路显著富集。选取7个变化最显著的铁死亡相关基因进行RT-qPCR验证。验证结果表明，这7个基因在6j处理的细胞中均上调。

图5

要点5：

A.通过分析来自TCGA和GTEx的RNA-seq数据，研究人员发现与正常组织相比，ATF3、ACSL1、LPIN1和DDR2在肝肿瘤中显著下调，而DDIT3显著上调(图5A)，这意味着这5个基因可能与肝癌相关。

B-C.随后，研究人员研究了这5个基因对肝癌患者OS和DSS的影响。研究人员发现ATF3和ACSL1高表达的患者具有显著较长的OS，而DDIT3高表达与较差的OS相关。DSS分析结果显示，ATF3、ACSL1、LPIN1高表达的肝癌患者DSS显著延长。以上结果提示ATF3和ACSL1可能与肝癌进展相关。

D.考虑到RNA-seq的结果，ATF3的变化比ACSL1更明显(ATF3的FC=1.34, ACSL1的FC=0.98)，研究人员假设ATF3可能是介导6j诱导铁死亡的关键基因。然后，研究人员进行ROC分析来评估ATF3的诊断效能，结果显示ATF3在肝癌中是一个中等的预测因子(AUC=0.769, CI=0.694~0.845)。ATF3是肝癌的潜在靶点，可能是介导6j诱导铁死亡的关键基因。

图6

要点6：

A-D.研究人员检测了6j处理后肝癌细胞中ATF3的表达。结果表明，在HepG2和MHCC-97H细胞中，6j以剂量和时间依赖性的方式显著升高ATF3蛋白。已有研究表明，ATF3是一种重要的应激相关蛋白，内质网应激的激活促进了ATF3的表达。RNA-seq和富集分析确定内质网应激被激活，表明6j可能通过内质网应激促进ATF3的表达。通过WB检测ATF3的表达后，用6j和内质网抑制剂4-PBA共同处理细胞进行验证。结果表明，抑制内质网应激减轻了6j诱导的ATF3上调。这些结果表明，6j诱导的内质网应激促进了ATF3的蛋白表达上调。

图7

要点7：

A-D.研究人员想知道ATF3的上调是否与6j诱导的铁死亡和细胞增殖抑制有关。研究人员首先在两个肝癌细胞系中检测了RNAi效率，发现siATF3 #2比siATF3 #1具有更高的效率。因此，选择siATF3 #2进行后续检测。siATF3 #2与6j共处理细胞，检测细胞内Fe²⁺含量、MDA含量、ROS含量及细胞活力。研究人员发现敲低ATF3通过降低细胞内Fe²⁺、MDA和ROS的含量来抑制6j诱导的铁死亡。ATF3的下调也减轻了6j诱导的细胞增殖抑制。这些结果证实了ATF3介导了6j诱导的铁死亡和随后的细胞增殖抑制。

图8

要点8：

A-B.与溶媒治疗组相比，6j低剂量组和6j高剂量组的肿瘤体积明显减小。

C.此外，6j低剂量组和6j高剂量组的肿瘤重量也明显减小。

D.Ki-67的IHC染色显示，在6j治疗中，Ki-67显著减少。

E-G.研究人员还发现6j以剂量依赖性方式显著增加ATF3在体内小鼠异种移植物的表达。Fe²⁺和MDA的含量也显著增加，呈剂量依赖性。

本文小结：

综上所述，该研究探讨了苦参碱碱衍生化合物6j作为肝癌细胞铁死亡诱导剂。与IC50大于5 mM的母本化合物苦参碱相比， 6j显示出显著的抗肝癌作用，IC50低于10μM。在机制上，6j通过诱导铁死亡发挥其抗增殖作用，而铁死亡在苦参碱碱诱导的增殖抑制中没有作用。研究人员发现苦参碱碱衍生物6j可以通过内质网应激上调ATF3在肝癌细胞中的表达。敲低ATF3可以消除6j诱导的铁死亡和增殖抑制。研究人员的数据进一步揭示了ATF3在铁死亡中的作用，并证明了ATF3是诱导铁死亡的药物设计的一个有前景的靶点。苦参碱碱衍生物6j，它通过ATF3介导的铁死亡表现出强大的抗肝癌作用。研究人员的结果表明，通过6j上调ATF3可能是治疗肝癌的潜在有效方法。这项工作也有局限性，包括6j诱导ATF3转录激活的机制，仍有待进一步研究。本研究为基于苦参碱碱结构设计铁死亡诱导剂提供了新的思路。

参考文献：

Tian K, Wei J, Wang R, et al. Sophoridine derivative 6j inhibits liver cancer cell proliferation via ATF3 mediated ferroptosis[J]. Cell Death Discovery, 2023, 9(1): 296. https://www.nature.com/articles/s41420-023-01597-6#Bib1.