IF13.6 Science Advances│D-乳酸调节M2型肿瘤相关巨噬细胞，重塑肝细胞癌免疫抑制性肿瘤微环境

前言：

2023年7月19日，吉林大学郭建锋及上海中医药大学余卓团队在Science Advances上发表了题为“D-lactate modulates M2 tumor-associated macrophages and remodels immunosuppressive tumor microenvironment for hepatocellular carcinoma”的研究论文，研究证实了DL将M2 TAM转化为M1的潜力，这种极化的机制主要是由于磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B途径的调节。聚丙交酯使用HCC膜和M2巨噬细胞结合肽（M2pep）对负载DL的纳米粒子（NP）进行修饰，形成纳米制剂（DL@NP-M-M2pep）。DL@NP-M-M2pep将M2 TAM转化为M1，并重塑了HCC小鼠中的免疫抑制TME，提高了抗CD47抗体对动物长期生存的功效。研究揭示了DL的潜在TAM调节功能，并为HCC免疫治疗提供了组合策略。

背景介绍：

肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌，全球每年新增的发病率和死亡率分别超过90万例和80万例。免疫治疗为不同的癌症提供了巨大的希望。然而，肝脏高度暴露于抗原和内毒素，这种稳态的潜在机制导致防止肝脏中针对特定抗原的免疫反应（称为免疫耐受）。此外，肝细胞癌变通常是由慢性炎症、纤维化和肝硬化引起的，这些病理条件会产生一种状态，即完全激活的效应免疫细胞不能诱导产生有效的免疫反应(被称为免疫无知)来抵抗肝细胞转化和肿瘤细胞增殖。由于这些原因，HCC表现出对免疫治疗抵抗的免疫抑制性肿瘤微环境(TME)。巨噬细胞是一个异质性的细胞群体，通常可以分为两个亚群，即经典活化的巨噬细胞(M1或M1样表型)和替代活化的巨噬细胞(M2或M2样表型)。肿瘤内的巨噬细胞，也称为肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)，是免疫抑制性TME免疫逃逸和肿瘤发生发展的关键调节者。

图文解析：

图1

要点1：

A.在本研究中，DL将TAMs从M2型转变为M1型，这主要是由于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路的抑制和核因子κB(NF-κB)通路的激活。

B.此外，本研究开发了一种M2型巨噬细胞结合肽(M2pep)靶向的HCC膜包裹聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒(NP)，用于将DL递送至HCC内的M2型TAMs。

图2

要点2：

A.在本研究中，用IL-4(M2型巨噬细胞)或干扰素-γ(IFN-γ)和脂多糖(LPS；M1型巨噬细胞)刺激骨髓(BM)来源的巨噬细胞(BMDM)来评估DL对巨噬细胞极化的能力。

B.RNA测序结果表明，DL处理M2型巨噬细胞后，M2型相关基因(如Arg1、Cd163、Cd206、Fizz、Il-10、Mmp2、Smad3等)显著下调，而M1型相关基因(如Ccl5、Cxcl9、Cxcl10、Nos、Il-1β、IL-12、Tlr2、Tlr9、Tnf-α等)显著上调。

C.此外，使用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)证实与巨噬细胞极化相关基因的表达。当用DL处理M2型巨噬细胞时，M2型功能标志物的表达显著下调(P<0.01,P<0.01,P<0.01)，而M1型功能标志物的表达显著上调(P<0.01,P<0.01,P<0.0001)。

D.流式细胞术结果显示，DL处理M2型巨噬细胞后，CD206⁺F4/80⁺群体(M2表型)(P<0.0001)显著降低，而CD86⁺F4/80⁺群体(M1表型)(P<0.0001)显著升高。

E.此外，M1型和M2型巨噬细胞具有不同的形态结构，这与之前报道的M1型和M2型巨噬细胞相似。值得注意的是，DL改变了M2型巨噬细胞的形态，使其与M1型巨噬细胞形态相似。因此，结果表明，DL将M2型巨噬细胞转化为M1型巨噬细胞。

图3

要点3：

A-B.随后使用M2型巨噬细胞研究了DL对巨噬细胞极化的影响机制。通过GO和KEGG的功能分析证明了DL调控的基因产物在PI3K/Akt通路上的富集。

C.与PI3K/Akt通路相关的基因产物在DL处理的M2型巨噬细胞中显著变化，显示该通路中33个基因上调(红色点)，64个基因下调(绿色点)。这些结果表明PI3K/Akt通路与DL介导的巨噬细胞极化密切相关。

D.在DL处理的M2型巨噬细胞中，PI3K和AKT1的活性被显著抑制。

E.采用分子对接预测DL在Toll样受体2(TLR2)和TLR9中的结合构象。结果表明，DL可能通过疏水相互作用(Trp⁵²⁹、His⁵³¹、Ala⁵⁰⁷、Lys⁵⁰⁵、Arg⁴⁸⁶)和氢键(Tyr⁴⁸³和Ser⁴⁸⁵)与TLR2相互作用（绿色）。DL可能通过疏水相互作用(His³⁹⁴、Arg⁴¹⁸、Phe⁴¹⁹、Lys⁴⁷²)和氢键(Thr³⁹⁵和Asn⁴⁷³)与TLR9相互作用（蓝色）。

F.通过TLR2和/或TLR9抑制剂预处理，在M2型巨噬细胞中进一步证实了DL与TLR2和/或TLR9的相互作用。结果显示，TLR2抑制剂、TLR9抑制剂以及TLR2抑制剂和TLR9抑制剂共同作用均能显著抑制DL对PI3K和NF-κB活性的影响。

G.结果表明，DL与TLR2和/或TLR9相互作用，诱导PI3K信号转导通路的抑制和NF-κB通路的激活，促进巨噬细胞从M2型向M1型极化。

图4

要点4：

A.在这项研究中，开发了一种靶向M2pep的HCC膜包裹的PLGA NP，用于将外源性DL递送至TME内的M2TAMs。

B.在M2pep嵌入的HCC膜表面包覆DL-loaded NPs(命名为DL@NP)后，靶向仿生纳米制剂(命名为DL@NP-M-M2pep)显示出类似于非靶向纳米制剂(DL@NP-M)的"膜-核"纳米结构。

C-D.此外，DL@NP-M-M2pep的粒径为⁓120nm，表面电荷为⁓-11mV，与DL@NP-M相近。值得注意的是，DL@NP-M-M2pep比DL@NP(~105nm,PDI≈0.1)具有更大的粒径(~120nm)，其差值(~15nm)与透射电子显微镜(TEM)观察到的膜厚度(~17nm)相近。

E.此外，DL@NP、DL@NP-M和DL@NP-M-M2pep具有相似的载药量(LC)，表明纳米制剂的完整性不受HCC膜包覆的影响。当DL@NP-M-M2pep在中性磷酸盐缓冲液(PBS)中孵育用于稳定性评价时，其尺寸和电荷没有明显波动。

F.结果如图所示，DL@NP-M-M2pep在中性环境(pH7.4)中孵育8h后，DL的释放量约为2%，而在酸性环境(pH5.5)中，DL的释放量显著增加(~20%)。孵育24h后，DL@NP-M-M2pep在pH7.4和5.5条件下分别释放~10和60%的DL。48h后，DL@NP-M-M2pep在pH7.4和5.5条件下分别释放~15%和80%的DL。

图5

要点5：

A.本研究采用流式细胞术检测了DL@NP-M-M2pep在M2型巨噬细胞中的靶向递送能力，结果表明，与PBS和DL@NP-M相比，DL@NP-M-M2pep在M2巨噬细胞中实现了更高的(P<0.001)摄取。

B.随后，在M2型巨噬细胞中证实了DL@NP-M-M2pep对巨噬细胞极化的有效性。与PBS和DL@NP-M相比，DL@NP-M-M2pep显著下调PI3K信号转导通路的活性，PI3K、AKT1、STAT6和PPAR-γ的活性也显著下调。相反，与PBS和DL@NP-M相比，DL@NP-M-M2pep显著上调了NF-κB通路的活性，包括AKT2、STAT1和NF-κB的活性。

C.抑制PI3K信号转导通路后，DL@NP-M-M2pep显著下调M2相关因子(如Arg1、Fizz、TGF-β、IL-10等)(P<0.001,P<0.01,P<0.001,P<0.001)的表达。因此，结果证实了DL@NP-M-M2pep在M2型巨噬细胞特异性递送DL促进M2型向M1型转化的潜力。

图6

要点6：

A.用健康小鼠考察了DL@NP-M-M2pep的体内毒性。结果表明，与PBS和游离DL相比，多次静脉注射DL@NP-M-M2pep(100mMDL)没有引起明显的体重下降。

B.此外，与PBS相比，DL@NP-M-M2pep处理组小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)未见明显损伤。

C.分析肝/肾功能以进一步评估全身毒性。血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)的水平与PBS相比，DL@NP-M-M2pep没有显著增加。这些结果证实了研究人员的纳米制剂在体内应用的安全性。

D.随后，在Hepa1-6-luc来源的原位肝癌小鼠中评估游离DL和纳米制剂中载药DL的半衰期。结果表明，与游离DL(DL≈2小时的t1/2)相比，DL@NP-M-M2pep中DL的血液循环时间显著延长。

E.此外，使用Hepa1-6-luc来源的原位肝癌小鼠评估DL@NP-M-M2pep的生物分布。在一次静脉注射载DiR的纳米制剂后24小时对主要器官和肝脏肿瘤进行成像。结果表明，与DL@NP相比，DL@NP-M-M2pep在肝脏肿瘤中观察到明显的(P<0.0001,均大于2倍)，这被纳米制剂(用DiR标记)递送到肿瘤中证实。相比之下，DL@NP-M-M2pep在肺、脾和肾中的(P<0.05,约为2倍)显著低于DL@NP。

F.此外，DL@NP-M表现出与DL@NP-M-M2pep相似的半衰期和生物分布。此外，采用CLSM考察了DL@NP-M-M2pep的TAM靶向递送能力。这些结果证实，DL@NP-M-M2pep由于HCC膜基和M2pep靶向修饰，改善了血液循环，肿瘤归巢和TAM靶向。

图7

要点7：

A.为了证实DL可能将M2型TAMs极化为M1型TAMs并重塑HCC中免疫抑制性TME的假设，首先在Hepa1-6-luc衍生的原位HCC小鼠模型中进行了治疗研究。

B-C.结果显示，与PBS相比，游离的DL(外源性DL自身)略微减缓了肿瘤的生长，而DL@NP-M与PBS和游离的DL相比，显著延缓了肿瘤的发展。值得注意的是，与游离DL和DL@NP-M相比，DL@NP-M-M2pep在21天内进一步抑制了肿瘤的生长。

D.因此，与PBS(中位生存期约13天)、游离DL(中位生存期≈16天)和DL@NP-M(10只小鼠中有1只>90天)相比，DL@NP-M-M2pep显著提高了动物存活率(10只小鼠中有6只>90天)。E.随后，研究人员证实了DL@NP-M-M2pep对巨噬细胞的调节在抗肝癌治疗中的有效性。免疫荧光染色结果显示，与PBS(~18%)、游离DL(~15%)和DL@NP-M(~6%)相比，DL@NP-M-M2pep(P<0.001)显著减少了肿瘤内F4/8⁰⁺Arg1⁺M2型TAMs的数量(~2%)；相反，DL@NP-M-M2pep(P<0.0001)与PBS(~0.1%)、游离DL(~1%)和DL@NP-M(~4%)相比，显著增加了肿瘤内F4/80⁺iNOS⁺M1的数量(~9%)。

F.此外，流式细胞术结果表明，与PBS、游离DL和DL@NP-M相比，DL@NP-M-M2pep(P<0.0001)显著减少了肿瘤内F4/80⁺CD206⁺M2型TAMs的数量；相反，与其他对照组相比，DL@NP-M-M2pep(P<0.0001)显著增加了肿瘤内F4/80⁺CD86⁺M1细胞的数量。这些结果表明，DL@NP-M-M2pep在TME内将M2型TAMs极化为M1型TAMs。

图8

要点8：

A.流式细胞术结果显示，与PBS、游离DL和DL@NP-M相比，DL@NP-M-M2pep显著下调肿瘤内MDSCs和Tregs等免疫抑制细胞(P<0.0001)的表达。相反，免疫刺激细胞，包括NK细胞，活化的树突状细胞(DCs)，CD8⁺细胞毒性和记忆性T细胞，以及CD4⁺辅助性和记忆性T细胞，与其他对照组相比，与其他对照相比，肿瘤内通过DL@NP-M-M0pep显着上调。

B-C.相应地，DL@NP-M-M2pep对免疫抑制性细胞的下调显著降低了IL-10、TGF-β、IL-4等免疫抑制因子的表达，DL@NP-M-M2pep对免疫刺激性细胞的上调显著增加了IFN-γ、TNF-α、IL-12等免疫刺激因子的表达。

D.此外，与PBS、游离DL(~5%)和DL@NP-M(~24%)相比，由DL@NP-M-M2pep实现的免疫抑制性TME的重塑显著(P<0.0001)导致肿瘤细胞凋亡(~57%)。这些结果证实了DL@NP-M-M2pep具有重塑免疫抑制TME并实现抗HCC免疫治疗的能力，这主要归功于其对TAM的调制作用。

图9

要点9：

A.如前所述，DL@NP-M-M2pep将TAM的极化状态从M2重编程为M1，重塑了HCC中免疫抑制的TME。随后，使用致癌物诱导的原位HCC小鼠评估了抗CD47抗体和研究人员的纳米制剂的联合功效。

B-D.结果表明，与PBS相比，α-CD47显著减缓了(P<0.05)的肿瘤发展，而DL@NP-M-M2pep取得了显著优于α-CD47的抗HCC功效。值得注意的是，与单独治疗相比，α-CD47和DL@NP-M-M2pep(P<0.0001)的联合治疗进一步抑制了肿瘤的生长，导致比PBS(中位生存期≈10天)、α-CD47(中位生存期约18天)和DL@NP-M-M2pep(中位生存期约40天)更长的动物生存期。

E.流式细胞术结果显示，与PBS和α-CD47相比，DL@NP-M-M2pep(P<0.001)显著降低了肿瘤内M2型TAMs(F4/80⁺CD206⁺)的数量，而DL@NP-M-M2pep和α-CD47的联合进一步降低了M2型TAMs的数量。

F.因此，与PBS，α-CD47(~9%)和DL@NP-M-M2pep(~43%)相比，通过研究人员的组合实现的免疫抑制性TME的转换显著(P<0.0001)诱导肿瘤细胞凋亡(~78%)。这些结果证实，研究人员的纳米制剂能够调节巨噬细胞极化以重塑免疫抑制性TME，与α-CD47联合使用可显著提高抗HCC疗效，为HCC提供了一种有前途的组合治疗方法。

本文小结：

综上所述，研究结果揭示了DL潜在的TAM调节作用，为“DL和抗CD47抗体”组合策略应用于HCC免疫治疗提供了概念上的证明。未来，应研究其他制剂材料和技术，以提高基于DL的纳米治疗药物的效率和实用性，以实现临床应用的组合策略。

参考文献：

Shulan Han et al. ,d-lactate modulates M2 tumor-associated macrophages and remodels immunosuppressive tumor microenvironment for hepatocellular carcinoma.Sci. Adv.9,eadg2697(2023).

DOI:10.1126/sciadv.adg2697

https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adg2697