IF4.861 Epigenetics│ZNF143通过靶向lncRNA NEAT1表达增加激活ROCK2通路，抑制肝细胞线粒体自噬，促进非酒精性脂肪肝疾病

前言：

2023年8月11日，南华大学衡阳医学院附属第一医院超声医学科董玉杰团队在Epigenetics发表论文题为“ZNF143 inhibits hepatocyte mitophagy and promotes non-alcoholic fatty liver disease by targeting increased lncRNA NEAT1 expression to activate ROCK2 pathway”的研究论文,本研究旨在探讨ZNF143/NEAT1/ROCK2/SND1轴在NAFLD发病中的作用机制。研究推测ZNF143诱导的lncRNA NEAT1上调可能通过调控ROCK2通路促进FFA处理的肝细胞和HFD喂养小鼠的肝脂肪变性和抑制线粒体自噬。

背景介绍：

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），由于代谢功能障碍与NAFLD发生发展的复杂机制密切相关，现在一些出版物将NAFLD更名为代谢功能障碍相关脂肪性肝病(MAFLD)是最常见的慢性肝病，全球患病率约为25%，随着肥胖率的上升，情况将变得更加严重。NAFLD最轻微的形式是脂肪肝变性，随后可进展为肝脏炎症、纤维化或硬化，导致失代偿，最终增加肝细胞癌的风险，这表明对NAFLD的有效治疗可大大减轻严重的肝脏病变。因此，研究NAFLD的发病机制十分必要和迫切。

线粒体自噬是在溶酶体帮助下进行的自我修复过程，已被证明可减轻急性和慢性肝损伤。研究表明，lncRNA NEAT1在NAFLD中过表达，敲低naat1可抑制游离脂肪酸(FFA)诱导的肝细胞脂质蓄积。此外，lncRNA NEAT1敲低通过增强线粒体自噬抑制糖尿病肾病的发展，揭示了lncRNA NEAT1在调节线粒体功能中的作用。Starbase预测lncRNA NEAT1/含葡萄球菌核酸酶结构域1(SND1)与ROCK2/SND1存在结合位点。SND1是一种rna结合蛋白，已被证明与肝脂肪变性中的低密度脂滴相关。然而，lncRNA NEAT1、SND1和ROCK2之间的相互作用是否参与NAFLD的发生发展尚不清楚。

图文解析：

图1

要点1：

A-B.在HepG2和Huh-7细胞中通过FFA处理(0、0.25、0.5、1或2mM)建立NAFLD模型。研究观察到，FFA处理以剂量依赖的方式抑制细胞活力，同时增加TG水平。

C-F.检测ZNF143和lncRNA NEAT1的表达。结果表明，FFA在体外以剂量依赖性方式上调其mRNA和蛋白水平的表达。ZNF143和lncRNA NEAT1在NAFLD细胞模型中的差异表达提示它们可能参与了NAFLD的进展。研究选择1mM的FFA浓度进行后续实验，因为它会导致细胞活力下降约50%。

图2

要点2：

A-C.检测ZNF143或lncRNA NEAT1敲低对FFA处理的HepG2和hh-7细胞脂肪变性的影响。研究对shZNF143和shNEAT1的敲低效率进行了评估，发现与shZNF143和shNEAT1转染的细胞相比，转染shZNF143和shNEAT1的细胞中ZNF143和lncRNA NEAT1的表达显著降低。

D-E.FFA处理可提高肝细胞TG水平，而敲低ZNF143或lncRNA NEAT1可逆转这种促进作用(图2,p<0.01,p<0.001)。此外，经FFA处理后，细胞显示出不同大小的红色脂滴，而敲低ZNF143或lncRNA NEAT1则减少了脂滴的形成。

F-K.FFA处理增加了体外脂质形成相关基因的表达，包括SREBP1、LXRα、SCD1、ACC1、FASN和CD36，正如预期的那样，ZNF143或lncRNA NEAT1敲低消除了这些基因的上调。这些结果表明，ZNF143或lncRNA NEAT1敲低可以减轻体外ffa诱导的肝细胞脂肪变性。

图3

要点3：

A-B.研究研究了ZNF143或lncRNA NEAT1敲低对FFA处理的HepG2和Huh-7细胞线粒体功能的影响。PINK1、Parkin、Beclin1、LC3II/I是与自噬相关的关键蛋白。因此，研究检测了它们的水平，并观察到FFA处理显著抑制了PINK1,Parkin,Beclin1,LC3II/I的表达，而敲低ZNF143或lncRNA NEAT1可以逆转这些基因的下调。

C.在共聚焦显微镜研究中，研究发现FFA处理抑制了Parkin的表达及其与线粒体标记TOM20的共定位，而敲低ZNF143或lncRNA NEAT1则逆转了这种抑制作用。综上所述，ZNF143或lncRNA NEAT1敲低增强了FFA处理的肝细胞的线粒体自噬，这可能在体外改善NAFLD。

图4

要点4：

A-B.为了评估ZNF143/lncRNA NEAT1的相互作用，研究检测了在FFA存在的情况下，用shNC或shZNF143处理的细胞中lncRNA NEAT1的水平。ZNF143敲低降低了FFA处理诱导的lncRNA NEAT1的高表达。然后，来自JASPAR的数据表明ZNF143和lncRNA NEAT1之间存在两个结合位点。

C-D.ZNF143抗体富集lncRNA-ZFAS1启动子的site1，而非site2(p<0.001)。此外，转染shZNF143可以抑制Pro或Pro#1驱动的细胞的荧光素酶活性，而不抑制Pro#2驱动的细胞的荧光素酶活性(p<0.05,p<0.01)。这些发现在体外证实了ZNF143与lncRNA NEAT1之间的靶向调控关系。

图5

要点5：

A.鉴于ZNF143和lncRNA NEAT1在ffa诱导的脂质形成中的功能以及ZNF143和lncRNA NEAT1之间的相互作用，研究有理由研究ZNF143/lncRNA NEAT1轴对肝细胞脂肪变性的影响。首先，转染NEAT1质粒后，细胞中lncRNA NEAT1表达增加。

B-C.研究lncRNA NEAT1过表达对shZNF143转染的NAFLD细胞脂肪变性的影响。在FFA处理的肝细胞中，lncRNA NEAT1的过表达增加了ZNF143敲低所降低的TG水平(p<0.01和p<0.001)。敲低ZNF143抑制NALFD细胞中脂滴的形成，而过表达lncRNA NEAT1则消除了这种抑制作用。

D.过表达lncRNA NEAT1后，沉默ZNF143导致的SREBP1、LXRα、SCD1、ACC1、FASN和CD36的下调增加(p<0.05,p<0.01,p<0.001)。这些结果表明，ZNF143在体外通过lncRNA NEAT1调控FA处理肝细胞的脂质形成。

图6

要点6：

A-C.ROCK信号通路可促进NAFLD的发展。研究发现FFA处理显著提高了HepG2和hh-7细胞中ROCK2的表达，敲低ZNF143或lncRNA NEAT1可下调ROCK2的表达，而过表达lncRNA NEAT1可逆转其抑制作用(p<0.001)，说明lncRNA NEAT1与ROCK2存在正调控关系。来自StarBase的数据显示，lncRNA NEAT1/SND1或SND/ROCK2之间存在一个结合位点。

E-F.lncRNA NEAT1探针富集SND1，验证了lncRNA NEAT1与SND1之间的靶向关系。SND1抗体可富集lncRNA NEAT1和ROCK2(p<0.01,p<0.001)。

G-H.lncRNA NEAT1的敲低显著抑制了SND1与ROCK2的结合(p<0.01)，以及ROCK2 mRNA的稳定性(p<0.01)。综上所述，lncRNA NEAT1通过靶向SND1激活ROCK2信号，增加肝细胞中ROCK2 mRNA的稳定性。

图7

要点7：

A-C.研究研究了lncRNA neat1激活的ROCK2通路对HepG2和Huh-7细胞脂质形成的影响。首先测定了shROCK2和ROCK2的转染效率。结果表明，转染shROCK2或ROCK2后，ROCK2的表达水平分别显著降低或升高。

D-E.敲低lncRNA NEAT1或ROCK2抑制了FFA处理诱导的高TG水平，而过表达ROCK2可逆转敲低lncRNA NEAT1的抑制作用。正如预期的那样，过表达ROCK2阻断了在ffa处理的细胞中沉默lncRNA NEAT1或ROCK2引起的脂滴减少。

F-K.LncRNA NEAT1或ROCK2敲低可下调SREBP1、LXRα、SCD1、ACC1、FASN和CD36的表达，而ROCK2过表达可逆转这一作用。这些发现表明lncRNA NEAT1在体外通过调控ROCK2促进肝细胞脂肪变性。

图8

要点8：

A-B.评价lncRNA NEAT1/ROCK2轴对细胞线粒体功能的影响。结果表明，lncRNA NEAT1或ROCK2的敲低会增加ffa诱导的PINK1、Parkin、Beclin1和LC3II/I的低表达，而ROCK2的共转染可以消除lncRNA NEAT1敲低的作用

C.lncRNA NEAT1或ROCK2的下调促进了线粒体中Parkin的表达，而ROCK2的同时过表达则显著逆转了这一作用。综上所述，lncRNA NEAT1在体外通过调控ROCK2抑制肝细胞的线粒体自噬。

图9

要点9：

A-C.研究观察到，与对照组小鼠相比，模型小鼠的体重显著增加，而shZNF143和shNEAT1组的体重受到抑制。GTT的结果表明，hfd喂养的小鼠的循环葡萄糖水平明显增加，而ZNF143或lncRNA NEAT1的敲低与GTT期间血糖的显著改善密切相关。胰岛素抵抗是NAFLD的关键病理生理学驱动因素。通过ITT，研究观察到在相同的胰岛素剂量下，hfd喂养的小鼠的血糖水平高于对照组小鼠。敲低ZNF143或lncRNA NEAT1可阻断高脂饮食诱导的胰岛素介导的低血糖的早期损害。

D-G.研究观察到，在hfd喂养的小鼠中，肝组织中的TG和TC水平上调，而注射shZNF143或shNEAT1显著降低了这些水平。如图9f所示，hfd喂养小鼠的肝组织出现明显的脂质空泡和液滴，而敲低ZNF143或lncRNA NEAT1可以改善肝组织的脂肪变性。敲低ZNF143或NEAT1后，hfd喂养小鼠血液中升高的ALT水平降低。HFD小鼠血清AST水平(87.22U/L)约为对照组(29.24U/L)的2倍，而沉默NEAT1或ZNF143可显著降低血清AST水平。

H-K.hfd可引起肝组织中lncRNA NEAT1和ROCK2的上调，而敲低ZNF143或lncRNA NEAT1可逆转这些变化。

J-K.此外，在NAFLD小鼠模型中，敲除ZNF143或lncRNA NEAT1后，PINK1、Parkin、Beclin1和LC3II/I的下调被抑制。这些发现进一步验证了ZNF143/lncRNA NEAT1/ROCK2轴在体内hfd诱导的肝组织损伤中的功能作用。

本文小结：

综上所述，研究表明ZNF143诱导的lncRNA NEAT1上调加剧了脂肪变性，同时通过与SND1结合增强ROCK2 mRNA的稳定性来抑制NAFLD中的线粒体自噬。研究结果ZNF143/lncRNA NEAT1/ROCK2轴参与为NAFLD发病机制提供了确凿的证据，不仅促进了对NAFLD发病机制的认识，而且有助于该疾病的靶点药物的开发，为NAFLD治疗提供潜在靶点。

参考文献：

Yujie D,Minjie H,Kewei T, et al. ZNF143 inhibits hepatocyte mitophagy and promotes non-alcoholic fatty liver disease by targeting increased lncRNA NEAT1 expression to activate ROCK2 pathway.[J]. Epigenetics,2023,18(1).

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15592294.2023.2239592