IF26 Journal of Hepatology│通过siRNA靶向N6-甲基腺苷读物YTHDF1抑制EZH2-IL-6轴增强NASH-HCC的抗肿瘤免疫

前言：

2023年7月15日，香港中文大学于君团队在Journal of Hepatology发表论文题为“Targeting N⁶-methyladenosine reader YTHDF1 with siRNA boosts anti-tumor immunity in NASH-HCC by inhibiting EZH2-IL-6 axis 2”的研究论文。该研究探讨了YTHDF1在NASH-HCC中的功能作用、分子机制及其与肿瘤免疫微环境的相互作用。该研究发现YTHDF1通过EZH2-IL-6信号传导促进NASH-HCC的肿瘤发生，其招募和激活MDSCs导致细胞毒性CD8⁺ T细胞功能障碍。YTHDF1可能是提高NASH-HCC抗PD-1免疫治疗应答的新靶点。

背景介绍：

肝细胞癌（HCC）是全球第六大常诊断癌症，也是癌症死亡的第三大原因。病毒性和非病毒性病因是肝细胞癌发展的基础。随着糖尿病和代谢综合征发病率的上升，NASH是肝细胞癌的一个日益增长的危险因素。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是一系列进行性肝脏疾病，其特征是甘油三酯的过度积累，而不是由于饮酒。尽管NASH与HCC的发病机制有关，但对这些疾病发作的分子机制的了解有限，阻碍了有效治疗策略的开发。到目前为止，仍然没有批准针对NASH-HCC的药物或生物疗法。这种致命疾病迫切需要新的疗法。最近，使用靶向程序性细胞死亡-1（PD-1）、程序性细胞死亡配体1（PD-L1）或细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（CTLA-4）的单克隆抗体的免疫检查点阻断（ICB）已成为HCC的一种治疗方式。然而，由于肝脏中NASH相关的免疫改变，NASH-HCC对ICB治疗的反应要差得多，强调迫切需要确定潜在的治疗靶点，以克服NASH-HCC对ICB治疗的耐药性。N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是真核mRNA中最丰富的化学修饰，已被证明参与转录后mRNA调控。m6修饰通过调节RNA的稳定性，核加工，转运，定位，翻译和RNA-蛋白质相互作用来调节RNA的命运.YT521-B 同源性 （YTH） N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1（YTHDF1）是一种促进翻译的m6招募翻译机制以靶向细胞质中mRNA的阅读器。YTHDF1通过调节细胞增殖、DNA损伤和免疫在肿瘤进展中具有多种作用.Ythdf1耗竭小鼠在结直肠中显示出抗原特异性CD8 T细胞介导的抗肿瘤反应升高和胃癌，推断YTHDF1是癌症免疫治疗的潜在治疗靶点。然而，YTHDF1在肝细胞癌，特别是NASH-HCC发病机制中的作用，以及肿瘤免疫微环境的调控仍知之甚少。在这里，研究人员首次揭示了肿瘤内在YTHDF1与NASH-HCC微环境中髓源性抑制细胞（MDSC）积累有关。在肝脏特异性YTHDF1过表达转基因小鼠中，YTHDF1诱导MDSC浸润并加速自发NASH-HCC。研究人员阐明了信号级联YTHDF1激活EZH2-IL-6信号通路以募集MDSC，从而引发T细胞功能障碍并促进肿瘤生长。最后，研究人员证明了使用脂质纳米颗粒（LNP）-siRNA靶向YTHDF1显着增强了NASH-HCC小鼠模型中的抗PD-1阻断效果，这意味着YTHDF1作为新的治疗靶点来提高NASH-HCC的免疫治疗效果。

图文解析：

图1

要点1：

A-B.首先分析了YTHDF1在NASH-HCC患者肿瘤和自发NASH-HCC小鼠模型中的表达。与成对的相邻肿瘤周围组织（n=1）相比，通过蛋白质印迹和免疫组织化学（IHC）方法表明，YTHDF1蛋白在NASH-HCC肿瘤中显著上调。

C.确定了两种自发小鼠NASH-HCC模型中的Ythdf1表达，二乙基亚硝胺（DEN）加高脂肪高胆固醇（HFHC）饮食模型和DEN加胆碱缺乏高脂肪饮食（CDHFD）模型，揭示了与正常饮食（ND）小鼠的正常肝脏相比，NASH-HCC肿瘤和NASH肝脏（无DEN）中的Ythdf1上调。YTHDF1在非NASH肝细胞癌患者和小鼠模型中也上调。高YTHDF1预测无病生存期和总生存期较差。综上所述，研究人员的数据表明YTHDF可能参与NASH-HCC和非NASH HCC的发病机制。

图2

要点2：

A-E.通过lsl-Ythdf1小鼠与Alb-cre小鼠交叉交配产生了肝细胞特异性Ythdf1过表达（Ythdf1 tg）小鼠，并通过蛋白质印迹和IHC染色证实。Ythdf1 tg小鼠和野生型（WT）小鼠用DEN加HFHC，DEN加CDHFD治疗26周以诱导NASH-HCC形成。血清甲胎蛋白（AFP）的评估显示Ythdf1 tg小鼠的AFP水平显着升高，这意味着Ythdf1 tg小鼠的肿瘤负荷比WT小鼠增加。在终点，与DEN加CDHFD小鼠中的WT小鼠相比，Ythdf1 tg小鼠的肿瘤数量增加，肿瘤直径和体积更大，肝脂肪变性加重，这在DEN加HFHC小鼠中得到证实。

F-G.仅喂食CDHFD（无DEN）的Ythdf1 tg和WT小鼠13个月以诱导自发性NASH-HCC。在仅CDHFD模型中，Ythdf1 tg小鼠的肿瘤数量显着增加，肿瘤直径和体积更大，以及肝脂肪变性加重。

H-J.与WT小鼠相比，Ythdf67 tg小鼠肝脏中Ki-1阳性细胞的百分比始终显着更高，这意味着Ythdf1过表达促进NASH-HCC中的细胞增殖。TUNEL 染色显示，与 WT 小鼠相比，Ythdf1 tg 小鼠的凋亡细胞显着减少。除HCC外，Ythdf1 tg小鼠具有更严重的饮食诱导的NASH，与WT小鼠相比，体重更高，葡萄糖和胰岛素耐量受损以及肝脏脂肪变性和炎症的组织学评估证明。除了NASH-HCC，肝脏特异性Ythdf1过表达也促进了喂食正常食物的DEN注射小鼠中的非NASH-HCC。研究人员的结果表明，肝脏特异性Ythdf1过表达加剧了小鼠的肝癌发生。

图3

要点3：

A-D.为了阐明YTHDF1促进NASH-HCC进展的潜在机制，在YTHDF1敲除（sgYthdf1）和对照（sgCtrl）人NASH-HCC HKCI-10细胞中进行了RNA测序。在YTHDF1敲除细胞中，153个基因上调，188个基因下调。顶部下调的途径富集了免疫系统和免疫系统中的细胞因子信号传导，这已通过基于京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库的基因集富集分析（GSEA）证实。这些结果表明，YTHDF1可能通过免疫调节对NASH-HCC发挥免疫调节作用。

E.为了深入了解NASH-HCC中肿瘤微环境（TME）内的细胞异质性，在Ythdf1 tg和携带NASH-HCC的WT小鼠中进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。研究人员观察到Ythdf0 tg小鼠（P<0.001）的NASH-HCC肿瘤中的单核细胞（P<0.001）和中性粒细胞/ PMN-MDSC（n=2）显着增加与WT小鼠（n=2）。

F-G.单核细胞显示M-MDSC标记基因Ccr2，Lyz2和Pld4，而中性粒细胞/ PMN-MDSC显示PMN-MDSC标记基因（包括S100a8/9，Arg2，Il1b和Ifitm1）的高表达，符合其作为MDSC的免疫抑制作用。MDSCs通过有效抑制抗肿瘤效应细胞（即T细胞，NK）来发挥其功能。细胞和NKT细胞。流式细胞术显示Ythdf3 tg小鼠的NASH-HCC肿瘤中MDSC以及还原的颗粒酶B CD8 T细胞和IFN-γ CD3 T细胞的诱导。

H. IHC证实Ly6G（MDSC标志物）增加，但Ythdf1 tg小鼠NASH-HCC肿瘤中的颗粒酶B和IFN-γ表达降低。总之，Ythdf1的肝脏特异性过表达增加了NASH-HCC和非NASH-HCC中的MDSC并抑制了细胞毒性CD8 T细胞，表明肿瘤免疫监测受损。

图4

要点4：

A-B. MDSC的产生和排出是由肿瘤分泌的细胞因子和趋化因子促进的。为了确定介导MDSC积累的因子，研究人员通过CRISPR-Cas1在RIL-175细胞中进行了Ythdf9敲除，这已通过DNA测序和蛋白质印迹证实。

C. 研究人员通过细胞因子1-Plex免疫测定分析了Ythdf31去除的HCC细胞的条件培养基。与sgCtrl相比，RIL-1细胞中的Ythdf175缺失显着降低了白细胞介素-6（IL-6），C-X-C基序趋化因子配体（CXCL）16和CXCL1的水平，但诱导了C-C基序趋化因子配体（CCL），CCL27和Fractalkine（CX3CL）。

D-E.在这些细胞因子和趋化因子中，Ythdf6敲除细胞中的IL-10降低了1倍，这已通过RIL-175细胞中的酶联免疫吸附测定（ELISA）测定和HKCI-27细胞中的Bio-Plex Pro细胞因子10-Plex免疫测定得到证实。与此一致，与WT小鼠相比，Ythdf6 tg小鼠血清和NASH-HCC肿瘤中的IL-1浓度显着增加。

F-G.使用来自sgCtrl和sgYthdf1 RIL-175细胞的条件培养基作为引诱剂进行了MDSCs迁移测定。如图4F所示，与sgCtrl相比，sgYthdf1细胞条件培养基中的MDSC迁移减弱。IL-6的添加部分恢复了MDSCs在sg Ythdf1细胞条件培养基中的迁移，这意味着IL-6是Ythdf1促进MDSC募集的下游效应子。接下来研究人员询问Ythdf1是否促进MDSC的功能。MDSC在来自sgCtrl和sg Ythdf1 RIL-175细胞的条件培养基中培养，揭示MDSC功能标志物包括iNOS，Arg-1，PD-L1，ASNS和IL-10在sgYthdf1组中均下调。

H-K.流式细胞术证实，Ythdf1敲除RIL-175细胞的条件培养基刺激MDSC功能的能力受损，如表面PD-L1表达降低所证明的那样（图4小时）。MDSC通过靶向CD8 T细胞发挥其免疫抑制作用。因此，研究人员进行了MDSCs和CD8 T细胞共培养。与sgCtrl组相比，在sgYthdf1细胞条件培养基中培养的MDSCs抑制CD8 T细胞增殖和效应功能（颗粒酶B和IFN-γ）的能力受损。补充IL-6挽救了在Ythdf1敲除RIL-175细胞的条件培养基中培养的MDSC的功能，包括PD-L1表达和对CD8 T细胞功能的抑制作用。这些结果在M-MDSC和PMN-MDSC中得到证实。总的来说，研究人员的数据表明，YTHDF1驱动的IL-6有助于MDSC的积累和功能，从而促进NASH-HCC的进展。

图5

要点5：

A.研究YTHDF1诱导IL-6分泌的潜在分子机制。YTHDF1是m⁶通过YTH结构域对A修饰的mRNA促进细胞质中的翻译，破译YTHDF1如何解释m⁶在NASH-HCC中修饰和调节mRNA翻译，应用多组学确定HKCI-1细胞中YTHDF10调控的下游靶点，包括m⁶甲基化RNA免疫沉淀测序（m⁶A MeRIP-seq），YTHDF1 RNA免疫沉淀测序（RIP-seq），核糖体分析（Ribo-seq），蛋白质组学和RNA测序。研究人员使用YTHDF1 RIP-seq绘制了与HKCI-10细胞中的YTHDF1结合的mRNA，从而鉴定了3541个转录本，富集度是RNA的2倍。m⁶MeRIP-seq和YTHDF1 RIP-seq数据集鉴定出2994个YTHDF1 靶基因。接下来，研究人员将Ribo-seq数据集与蛋白质组学相结合，以揭示四个YTHDF1靶基因（EZH2，JUN，RRM1，CIRBP），在YTHDF1敲除后翻译效率显着降低。值得注意的是，IL-6没有被发现是YHTDF1的直接靶标，促使研究人员假设YTHDF1可能通过替代靶点诱导IL-6分泌。

B-D.在候选基因中，已报道EZH2调节HCC16中IL-6的产生和MDSC的招募。ChIP-qPCR分析显示EZH2直接结合到IL-6启动子上。因此，研究人员想知道YTHDF1是否通过EZH2调节IL-6的产生和MDSC的招募。研究人员证明了Ezh2 mRNA通过RIP-qPCR与Ythdf1结合。多聚体分析显示，在sgYthdf1细胞中，Ezh2 mRNA与核糖体的结合减少。一致的是，Ythdf1的敲除显著抑制了EZH2的翻译效率，但不影响其mRNA的表达。这在RIL-175细胞中通过RNC-qPCR得到了验证。与Ythdf1诱导的Ezh2翻译一致，Ythdf1的耗尽导致RIL-175和Hepa1-6细胞中Ezh2蛋白的降低。相反，过表达Ythdf1导致RIL-175和Hepa1-6细胞中Ezh2蛋白表达增加，并且在Ythdf1 tg小鼠的NASH-HCC肿瘤中也有增加。

E-I.为了评估Ezh2在Ythdf1介导的MDSC激活中的作用，研究人员沉默了控制载体（oeNC）和Ythdf1过表达的RIL-175细胞中的Ezh2或IL-6，随后建立了正交的NASH-HCC模型。Ythdf1的过表达促进了NASH-HCC的发展，表现为肿瘤重量的增加和细胞增殖的增加。无论是Ezh2还是IL-6的沉默都消除了Ythdf1在RIL-175细胞中的肿瘤进展。流式细胞术和免疫组织化学染色还显示，无论是Ezh2还是IL-6的沉默都逆转了Ythdf1诱导的MDSC的积累，以及NASH-HCC肿瘤中细胞毒性CD8 T细胞的抑制。

图6

要点6：

A-D.将小鼠HCC RIL-175或Hepa1-6细胞注射到喂养CDHFD饮食的小鼠的肝囊内，建立了正交的NASH-HCC小鼠模型，其中包括或不包括Ythdf1敲除。研究人员发现，抗PD-1疗法与抗IgG治疗相比，在NASH-HCC小鼠中没有改善总体生存率。Ythdf1的敲除改善了总体生存率，并且与抗PD-1抗体治疗的联合显著改善了总体生存率。与此一致，单一的抗PD-1治疗对sgCtrl肿瘤的生长没有影响。同时，Ythdf1的敲除与抗PD-1阻断显著协同作用，抑制肿瘤生长，表现为肿瘤重量的减少，Ki-67染色法测得的细胞增殖的减少，以及TUNEL实验测得的细胞凋亡的增加。

E-F. 流式细胞术显示，来自Ythdf1敲除RIL-175或Hepa1-6细胞的正交NASH-HCC肿瘤，在注射IgG或抗PD-1的处理下，肿瘤浸润的MDSCs，包括PMN-MDSCs和M-MDSCs显著减少。

G-H.与WT肿瘤相比，来自Ythdf1敲除RIL-175肿瘤的M-MDSCs和PMN-MDSCs对CD8 T细胞的免疫抑制作用减弱。一致的是，在两个NASH-HCC正交小鼠模型中，与sgCtrl对照组相比，Ythdf1敲除组接受抗PD-1治疗的CD8 T细胞中的IFN-γ和Granzyme B水平被协同诱导。因此，Ythdf1的敲除促进了NASH-HCC中抗PD-1疗法的疗效。

图7

要点7：

A. LNP-siRNA是一种潜在的治疗选项，用于疾病治疗。由于YTHDF1的抑制剂尚不可用，研究人员使用了一种经FDA批准的LNP配方来传递靶向Ythdf1的siRNA。首先，研究人员设计了靶向Ythdf1的siRNA，并在体外确认了其敲低效果。

B-D. 为了提高体内稳定性，siRNA的两个链中的所有嘧啶碱基都被2'-O-甲基（2'-OMe）修饰。LNP-siYthdf1有效地靶向RIL-175细胞中的Ythdf1，通过免疫染色和流式细胞术得到证实。此外，尾静脉注射后，LNP-siYthdf1在小鼠肝脏中明显积累。因此，研究人员使用RIL-175细胞建立了正交的NASH-HCC模型。在植入肿瘤细胞后的第七天，小鼠被随机分组并接受LNP-siYthdf1、抗PD-1治疗，或两者的联合治疗。

E-G. LNP-siYthdf1显著降低了小鼠NASH-HCC肿瘤中的YTHDF1蛋白水平。LNP-siYthdf1与抗PD-1联合治疗协同减少了肿瘤负担和细胞增殖，但增加了细胞凋亡，而单独使用抗PD-1则没有效果。

图8

要点8：

A-E. LNP-siYthdf1与抗PD-1治疗联合显著减少了MDSC的招募和激活CD8 T细胞功能，通过流式细胞术和免疫组织化学染色得到证实。这些发现表明Ythdf1在增强NASH-HCC中抗PD-1疗法的潜力。

本文小结：

综上所述，该研究探讨了YTHDF1在NASH-HCC中的功能作用、分子机制及其与肿瘤免疫微环境的相互作用。结果表明，在NASH-HCC患者中，YTHDF1在肿瘤组织中比邻近肿瘤周围组织过表达。自发性NASH-HCC饮食模型中肝脏特异性Ythdf1过表达驱动肿瘤发生。scRNA-seq和流式细胞术揭示了Ythdf1诱导髓源性抑制细胞 (MDSCs)的积累并抑制细胞毒性CD8+ T细胞功能。机制上，Ythdf1在NASH-HCC细胞中的表达诱导IL-6的分泌，IL-6介导MDSCs的募集和激活，导致CD8+ T细胞功能障碍。综合m⁶A-seq、RIP-seq和ribo-seq鉴定出EZH2 mRNA是YTHDF1的关键靶点。YTHDF1与m⁶A结合修饰的EZH2 mRNA并促进EZH2翻译。EZH2反过来增加了IL-6的表达和分泌。Ythdf1基因敲除联合抗PD-1治疗抑制NASH-HCC同种异体移植物肿瘤生长。此外，LNP包封siRNA靶向治疗Ythdf1可显著提高NASH-HCC同种异体移植物抗PD-1阻断的疗效。总之，该研究发现YTHDF1通过EZH2-IL-6信号传导促进NASH-HCC的肿瘤发生，其招募和激活MDSCs导致细胞毒性CD8⁺ T细胞功能障碍。YTHDF1可能是提高NASH-HCC抗PD-1免疫治疗应答的新靶点。

参考文献：

Wang L, Zhu L, Liang C, et al.Targeting N6-methyladenosine reader YTHDF1 with siRNA boosts anti-tumor immunity in NASH-HCC by inhibiting EZH2-IL-6 axis[J].Journal of Hepatology, 2023. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2023.06.021